抗结核药物药效学非临床研究技术指南

朱慧 徐建 郭少晨 陈曦 陆宇

摘要：研发新型抗结核药物极具挑战性，难度大，周期长，非临床研究的数据是开展临床试验的前提。全面充分的结核分枝杆菌体外和在动物体内的药效学评价是临床试验前的重要步骤和关键内容。本技术指南主要适用于治疗由结核分枝杆菌引起的肺结核病药物的研发，旨在为创新抗结核药物的临床前药效学研究提供参考。

关键词：抗结核药物；药效学；技术指南

中图分类号：R978.3文献标志码：A

Abstract    The development of new anti-tuberculosis drugs is extremely challenging， difficult and time-consuming. Non-clinical research data is the basis for conducting clinical trials. Comprehensive and adequate pharmacodynamic evaluation of Mycobacterium tuberculosis in vitro and in animals is an important step and key content before clinical trials. This technical essentials are mainly applicable to the research and development of drugs for the treatment of pulmonary tuberculosis caused by Mycobacterium tuberculosis， and aims to provide a reference for the preclinical pharmacodynamic research of innovative anti-tuberculosis drugs.

Key words    Antituberculosis agents; Pharmacodynamic; Technical guidelines

肺結核病的传染源是结核分枝杆菌，据WHO估算，全球有接近20亿的结核潜伏感染人群。多药组合的化学治疗是人类控制结核病的主要手段，抗结核治疗需要新作用机制的药物和有效的联合治疗方案。随着耐多药结核病（multidrug-resistant tuberculosis， MDR-TB），广泛耐药结核病（extensively drug-resistant tuberculosis， XDR-TB）的日益增多，有效的新药及新方案亟待研发。研发新型抗结核药物极具挑战性，难度大，周期长。临床试验开始前应进行非临床研究，全面充分的结核分枝杆菌体外和在动物体内的药效学评价是临床试验前的重要步骤和关键内容。目前国际上还没有统一的抗结核新药的药效学评价方法和标准，我国尚缺乏系统、科学、规范的药效评价技术指导原则。随着我国抗结核新药研发的不断增加以及抗结核药物药效学评价技术的不断成熟和完善，为我国抗结核新药研发临床前药效学研究提供更加精准的技术指导，解决药效学评价中的重点问题，保证数据完整性，中国药理学会化疗药理专业委员会和首都医科大学附属北京胸科医院组织国内专家制定了《抗结核药物药效学非临床研究技术指南》，为注册申请人、研究者在规划、设计、实施药效学非临床研究提供技术指导。

本技术指南适用于单一抗结核药物的研发，且主要针对肺结核病用药，肺外结核、潜伏感染、预防性用药等并不在本指南适用范围内。尤其关注可以减少敏感结核疗程的，对耐药结核病有效的药物。对于两药组合的方案以及固定剂量复合制剂，可作为参考。

所有与结核分枝杆菌菌株接触的实验操作必须在生物安全实验室内进行。抗结核药物的临床前药效学研究分为体外活性评价和体内活性评价。

1 体外研究[1-4]

1.1 最低抑菌浓度（MIC）测定

体外研究首先需要测定药物的抗菌活性，包括杀菌、灭菌活性。结核分枝杆菌生长包括对数生长期（复制期）和休眠静止期（非复制期）。研究药物对复制期细菌的活性称为杀菌活性;对非复制期细菌的活性则为灭菌活性。描述抗菌活性的重要指标之一是最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC），MIC测定应采用标准化方法，有液体培养基中结核分枝杆菌生长、代谢反应检测方法和传统固体培养基表型检测方法。观察结核分枝杆菌生存情况可以通过菌落计数或荧光检测的方法，应用液体培养基培养7～10 d后添加指示剂，添加指示剂后避光培养过夜，通过检测吸光度来判断菌株生长情况。应用含药琼脂培养基进行MIC测定的，需要培养3～4周，3～4周后进行菌落计数。菌株应具有地区代表性，并应包含有代表性的不同耐药情况的样本， 一般应选择近2～3年的临床分离菌，一些收集困难的菌种可考虑5年内的临床分离株。

1.2 最低杀菌浓度（MBC）测定

最低杀菌浓度（minimal bactericidal concentration， MBC），指在给定条件下培养一定时间能杀死大部分（≥99.9%）接种受试活菌数的最低药物浓度。最低杀菌浓度的检测方法可以通过将MIC实验中培养菌液原液或稀释液涂布至不含抗结核药物的琼脂培养基中，培养3～4周观察能够杀死结核分枝杆菌的最低药物浓度，即MBC。

MIC和MBC均为静态观察药物或化合物与菌株之间相互作用的评价指标，可以作为初步评价化合物的抗结核活性的指标。作为评价抗结核活性的重要指标，MIC和MBC只能提供一个时间点化合物的抗结核活性，不能全面评价化合物对结核分枝杆菌生长的作用，具有一定局限性。

1.3 杀菌曲线（time-killing curves）

杀菌曲线可以动态观察药物（化合物）与结核分枝杆菌相互作用的情况，能够比较不同浓度化合物在不同作用时间下对结核分枝杆菌生长的影响，为评价化合物的抗结核活性提供更多依据。通过绘制杀菌曲线可以判断化合物抗结核活性为时间依赖性或浓度依赖性，为后续药动学（PK）研究和药动学/药效学（PK/PD）研究提供依据。菌株可以是结核分枝杆菌标准株或临床株。初始菌液浓度约为5×105 CFU/mL。当评价单一化合物的抗结核活性时，实验组中待测化合物浓度需要参考该化合物MIC值进行设定，从低浓度至高浓度，药物浓度通常为1/2×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC，结核分枝杆菌在含药培养基中连续培养14 d，期间每隔3～4 d取部分菌液在固体培养基上培养，培养3～4周后进行计数。菌落数取对数值作为纵坐标，以时间为横坐标绘制曲线即杀菌曲线。与初始接种量相比，如果药物可导致菌落计数降低3个log值及以上（相当于杀死99.9%以上的初始接种菌），则可判断药物具有杀菌活性。杀菌曲线也用于在体外评价药物组合中各药物间的相互作用。

1.4 巨噬细胞内抗结核活性检测

结核分枝杆菌在巨噬细胞内存活，需要评价研究药物的胞内杀菌活性。用于结核分枝杆菌感染的巨噬细胞系常选用RAW264.7和J774.1两种。细胞培养后将结核分枝杆菌感染，加入药物处理一般72 h，裂解细胞；进行结核分枝杆菌活菌计数，比较化合物处理组与未经化合物处理组及阳性对照药处理组中巨噬细胞内结核分枝杆菌的数量。由于测定巨噬细胞内结核分枝杆菌生长数量的方法需要裂解细胞并将裂解液进行培养及计算菌落的个数，因此此方法缺点在于耗时较长。

1.5 結核分枝杆菌自发突变率的检测

在体外研究中，可使用自发突变率（野生型菌株暴露于药物下发生突变的频率）来评估菌株耐药的风险，但这一方法对体内试验时联合用药的耐药风险可能无法预测。若使用耐药菌株评估，风险较高且可能对临床试验中单药的设计产生影响。此方法是将结核分枝杆菌标准株H37Rv培养至对数生长期后浓缩至108 CFU/mL，取100 μL分别涂布至含药（含4×MIC药物浓度）及不含药7H10固体培养基，培养4周后进行菌落计数。计算突变率。

1.6 体外药效学相互作用

体外药效学相互作用（pharmacodynamic interactions）是指对研究药物的相互作用、有效剂量进行评估，从而确定其进一步研发为肺结核治疗方案药物的可行性。目前常用的定量方法是棋盘稀释法。以两种药物的相互作用为例，首先分别测定两个研究药物对结核分枝杆菌的MIC，根据MIC值，设定最高浓度为单药的2×MIC，再逐一进行2倍稀释（分别在方阵的纵列和横列进行），每管（孔）中分别是两种药物不同浓度组合的混合液，一般设计6～8个稀释度。初始接种菌量为5×105CFU/mL，在37℃孵育7 d，观察结果并计算部分抑菌指数（fractional inhibitory concentration， FIC）。FIC指数计算公式（A药联用时的MIC/A药单测时的MIC）+（B药联用时的MIC/B药单测时的MIC）。根据FIC值判断为协同作用（＜0.5）、相加作用（0.5～1）、无关作用（1～2）和拮抗作用（＞2）。

1.7 作用机制

需要对抗结核药物的作用机制进行研究，从而为其组成有效治疗方案提供依据。作用机制研究方法可参考一般抗菌药物。

1.8 耐药性及其机制

结核分枝杆菌分离株对研究药物可能产生耐药性，应选择适当的体外和/或体内模型进行评估。同时，还应关注交叉耐药（同类药物间、与其他类药物间）。若细菌产生耐药性，需要进一步研究耐药机制。在非临床研究中，如发现表观型/基因型的变化，可对其临床意义尝试评估，例如体外药敏。

2 体内研究[4-15]

动物模型是研究药物体外抗结核分枝杆菌活性和人体临床试验之间的一个重要桥梁。小鼠最常用于抗结核药物体内药效学评价，其次是豚鼠， 非人灵长类；感染途径一般包括气溶胶、气管、鼻腔、静脉、腹腔等；分析、评价手段可通过对动物肺、脾进行脏器菌落计数，脏器病理和抗酸染色等方法。

2.1 小鼠

是抗结核评价使用最广泛的动物，具有易于操作、价格便宜、所需化合物量少的优点。小鼠品系有BALB/c、C57BL/6、C3HeB/FeJ等，一般可采用气溶胶雾化感染、滴鼻感染或尾静脉注射等方法。小鼠结核病模型不形成干酪样肺病变和空洞，只形成非坏死性细胞肉芽肿，主要由淋巴细胞、上皮样巨噬细胞和泡沫巨噬细胞组成。几乎所有结核分枝杆菌都在巨噬细胞中，因此主要反映化合物的胞内抗结核活性。高剂量感染（肺中定植5000CFU或更高）结核分枝杆菌的小鼠可以在感染后4～6周死亡，低剂量感染免疫缺陷小鼠（例如无胸腺裸鼠或γ干扰素敲除小鼠）也会产生同样的结果。低剂量感染（肺定植10～500CFU）免疫健全小鼠如BALB/c和C57BL/6，获得性免疫反应可以限制感染的进展，感染后4周肺荷菌量进入平台期，形成长期存活的慢性感染。

小鼠急性感染模型：模拟人体急性感染状态，是在小鼠体内免疫反应未完全建立，肺中的结核分枝杆菌活跃生长时，开始药物治疗，评价药物对增殖期细菌的抑制/杀灭能力，时间一般在2周内。一般可采用气溶胶雾化感染、滴鼻感染或尾静脉注射等方法进行大剂量结核分枝杆菌的感染，感染后1～2周开始治疗，药物对复制期的结核分枝杆菌治疗1～4周。停药后，安乐处死小鼠，无菌操作下解剖，组织匀浆，10倍稀释后涂在固体培养基上进行37℃培养和活菌计数。评价指标： 肺、脾的活菌计数，小鼠存活率，体重变化，组织病理学检查等。

小鼠慢性感染模型：慢性模型是模拟人体感染的持留状态，在小鼠免疫反应已建立，肺中的结核分枝杆菌缓慢生长或进入平台期时，才开始治疗。此模型中具有良好活性的药物，在临床治疗中有可能缩短疗程。慢性感染模型通常使用低剂量菌感染小鼠（30～100CFU/肺），小鼠有充足的免疫反应，感染后可存活数月至1年以上，且肺脏荷菌量不会超过6～6.5 log10CFU。感染结核分枝杆菌3周后开始治疗。在治疗相应时间后（通常以1个月、2个月治疗多见），解剖小鼠，取出肺、脾等组织，研磨均匀后，接种用于CFU计数。最后统计分析各组数据，对化合物作出评价。

C3HeB/FeJ小鼠模型：C3HeB/FeJ小鼠在合適的条件下感染结核分枝杆菌后能形成干酪样病灶。C3HeB/FeJ小鼠的肺病理存在异质性，因此实验需要小鼠的数量比BALB/c小鼠数量多。气溶胶感染结核分枝杆菌50～75个CFU后，形成3种典型的肺病灶：爆发性坏死性肺泡炎、组织有序的干酪样肉芽肿和细胞肉芽肿。一般感染5～6周后，可以形成干酪样坏死。1/3至2/3的小鼠形成结构有序的干酪样肉芽肿，中间干酪化，周边纤维化和类似大型种属包括人的无氧特性。大的干酪样肉芽肿会随着感染时间的延长形成空洞病灶，空洞可以通过计算机断层扫描（CT）发现。空洞病灶在人感染结核分枝杆菌后也会形成。该模型可以评价化合物进入空洞病灶的杀菌活性。考虑到干酪样病灶对结核药物的PK/PD影响，C3HeB/FeJ小鼠的组织病理学的改变能较好地用该种小鼠反应药物对患者的活性。

2.2 豚鼠

相对于小鼠，豚鼠对结核分枝杆菌更易感，通常极少量的活菌（20～30个CFU）的气溶胶感染就可在豚鼠体内形成感染。豚鼠感染后，可在肺部形成典型的肉芽肿结构，且可发展为干酪样坏死，其肺部坏死灶、淋巴结结核和结核病的播散情况，使得豚鼠模型可以更好地模拟人类结核病的特征。但相对于小鼠，豚鼠价格较贵，操作较麻烦，而且豚鼠对结核分枝杆菌高度易感，具有强抗结核活性的研究药物才能在豚鼠模型得到较好的评价。豚鼠模型更多地用于抗结核活性确证及治疗方案的评价，一般较少用于抗结核新药的初筛。在近似菌量负载下，相比于BALB/c小鼠，豚鼠的治疗效果更显著。对于再次确定或修正小鼠体内得到的结果，尤其是缺氧的微环境模拟，豚鼠是比小鼠更优的选择。在涉及这方面的研究时，需要提供豚鼠模型的结果。其研究策略包括但不限于如下内容：

（1） 选择无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级4～6周龄豚鼠（Hartley品系），体质量为300～350 g；将实验动物随机分组，各组动物分笼饲养，自由饮食饮水，饲养条件保持恒温恒湿，并定期通风消毒。

（2）利用加入0.05%的Tween 80的7H9液体培养基培养结核分枝杆菌H37Rv菌株至对数生长期，并利用H37Rv菌株的生长曲线或A570/600测定菌液的浓度。

（3）利用微生物气溶胶发生器制备感染物的气溶胶悬液，以气溶胶方式感染豚鼠：5×106 CFU/mL的菌悬液，置于雾化器中，气溶胶装置感染，感染10天后，可解剖基线豚鼠检测感染是否成功（肺脏荷菌量达到103～104/105CFU），3～4周后可开始治疗。

（4）根据实验设计，对各治疗组使用弯头灌胃针进行灌胃给药，通常治疗4～8周，期间根据动物体重增长及时调整药物剂量。

（5）在预定的治疗结束时间点解剖豚鼠，取脏器（通常为肺、脾），加入无菌生理盐水/PBS研磨脏器组织。

（6） 活菌计数：稀释度根据脏器病变程度确定，进行10倍梯度稀释，取适当体积的不同稀释度菌液，接种于结核分枝杆菌培养基，37℃恒温箱培养，3～4周后进行菌落计数，并计算每只豚鼠肺脏和脾脏的活菌数，以对数形式表示。

（7）比较各组间差异，评价不同化合物或组合方案的效果。评价指标包括但不限于：豚鼠体重，脏器重量变化，脏器活菌计数结果，病理结果。

2.3    非人灵长类

主要是犬齿猕猴、恒河猕猴被用于临床前抗结核药物评价。通过支气管滴入大约25个CFU的结核分枝杆菌，可以在随后6～8个月形成近似等比例的活动性结核病或亚临床/潜伏感染。正电子断层扫描显像（PET-CT）在感染后3周可以鉴定动物是否会发展为活动性或潜伏结核。大剂量滴注（1000个CFU）会在较短时间获得高比例的活动性结核。活动性结核病可以通过以下特点鉴别：症状例如咳嗽、体重降低等，红细胞沉降率升高，胸片异常，胃吸入和支气管肺泡灌洗液培养阳性。药物疗效评价的治疗终点包括胃吸入或支气管肺泡灌洗液活菌计数、系列PET-CT成像终点、器官CFU评分和病理学评分等。猕猴用于临床前药效评价面临许多挑战，例如不容易获得，价格非常昂贵，需要特殊的饲养条件和伦理问题等。

3    总结

综上，实验室可根据自身条件，采用多种不同的小鼠模型用于抗结核新药筛选与评价，而不限于采用同一种模型，但一般应包括小鼠急性与慢性感染模型。同时，考虑到对结核感染多方面活性的评估，可以使用不同的结核分枝杆菌菌株/动物模型，来评价单个药物/治疗方案。实验室内部应具备统一、规范的方案和方法，包括但不限于标准菌株、感染菌量、感染方式、对照药物以及治疗时间等。菌株的选择，可能是影响头对头（head to head）试验结果比对的最重要条件。推荐使用不同菌株，如能获得临床分离菌株，也可使用。所使用的结核菌株应具有良好的生长状态，较少的传代次数，毒力保持良好且背景清楚。

评价研究药物的治疗效果，其在联合治疗方案中的作用，确定研究药物在临床试验中使用的剂量、治疗方案等，都可以通过动物模型来进行。如果结核分枝杆菌菌株表现出对某一药物的敏感性降低，也可以在相应的动物模型中评估其是否适合产生和维持临床上明显的感染症状。通过体外数据与动物模型，可推论联合试验方案是否对结核分枝杆菌复合群的其他菌株有效。

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基金項目：国家自然科学基金（No. 82173862）；北京市医院管理中心临床医学发展专项（No. ZYLX202123）

作者简介：朱慧，女，生于1977年，博士，副研究员，研究方向为抗结核药物药理学，E-mail： zhuhui06@tsinghua.org.cn