人工栽培条件下森林草莓花粉活力和萌发状况观测

靳智翔，吕鑫磊，段雨杉，王尧，余茜颖，龙鸿

（天津农学院 园艺园林学院，天津 300392）

草莓属植物是全球主要浆果类水果，是其他浆果产量的两倍[1]。草莓富含维生素C、叶酸和锰元素，以及酚类物质，如花青素苷、单宁和石碳酸等，具有较高的营养价值[2]。该属常见栽培种凤梨草莓（Fragaria×ananassa）为八倍体，而其他种类均为野生，栽培草莓起源已分析清楚，其遗传背景相对狭窄[3-4]，造成其抗逆性降低，新品种繁育困难[5]。野生草莓是草莓品种育种的优良资源库，野生二倍体森林草莓（Fragaria vesca）分布广，适应性强，可以用作栽培草莓育种的重要种质资源，是蔷薇科果树育种研究的模式植物。森林草莓的类黄酮、多酚、花青素、VC等含量较高，可作为栽培草莓品质育种的重要基因来源[6]。此外，森林草莓基因组小，仅206 Mbp[7]，与其他多年生栽培品种比较，植株体型小、易于种植于可控环境中，能进行有性和无性繁殖[8]，是草莓属研究的理想模式植物，促进了蔷薇科植物在生产实践中的应用[7,9]。森林草莓是草莓属重要的资源植物，关于其基本生物学特性研究有利于挖掘其在生产实践中的应用价值。

传粉和受精是被子植物有性生殖的重要环节。花粉的萌发是杂交育种的前提，与花粉的活性和萌发条件相关。森林草莓花粉活性和萌发条件未见详细报到。促成栽培条件下，草莓同一植株上不同花的开花时间经常不一致，一朵花开放时，其他花仍未开[10]，尤以不同种间开花时间差距更大，为杂交育种带来不便。本文以森林草莓为材料，研究其花粉活性和萌发条件，以期为草莓杂交育种提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

森林草莓（Fragaria vesca）Ruegen材料由华中农业大学园艺林学学院康春颖教授馈赠，植株材料为匍匐茎繁殖的幼苗，种植于人工气候室培养，16 h光照/8 h黑暗，光强为180 µmol/m2·s，温度20～25℃，湿度为60%～80%，2020年3—4月陆续开花。

1.2 试验方法

1.2.1 花药和花粉活力的形态检测

待森林草莓现蕾至开花期，参考王壮伟等[11]（2010）方法，取小蕾、中蕾（露白）、大蕾、开花初期（花粉未散）及开花盛期（花粉已散）的花药及其中的花粉，分别置于载玻片上，利用Leica S8体式显微镜和OlympusBX53正置显微镜下进行形态观察，Spot-Idea相机拍照。

1.2.2 花粉活力测定

花粉活力测定采用 I-KI染色法[12]，如 1.2.1方法采集不同时期花粉，1% I-KI溶液染色，OlympusBX53显微镜观察，Spot-Idea相机拍照。

1.2.3 花粉萌发观测

参考1.2.1方法，采集不同时期花药，待花药自然干燥10 min后，用镊子将花药破壁，将其中的花粉均匀散布于滴于载玻片上的液体培养基中，培养基成分为15 g/L蔗糖＋0.3 g/L硼酸＋0.3 g/L碳酸钙[13-14]，25 ℃培养 4～5 h。OlympusBX53 显微镜下观察并统计发芽率，每个玻片下观察15个视野，采用SPSS 25软件分析数据。

2 结果与分析

2.1 森林草莓花药发育的形态观察

分别采集小蕾、中蕾、大蕾、开花初期及开花盛期5个时期的花药在体式显微镜下观察，镜检结果分为两类，第一类为未开花的小蕾、中蕾、大蕾，其花药呈心形，边缘规则，依稀可见其中花粉粒呈鹅黄色颗粒状，但并未散出（图1A）。第二类为已开（包括刚开和盛开）花的花药，有的形态与未开花的基本相同；有的形态与未开花的花药相似，但边缘皱缩，其中的花粉粒也未散出（图1B）；有的花药边缘开裂，鹅黄色花粉粒开始散出（图1C）；有的花药边缘完全裂开并卷曲，花粉粒完全散出（图1D）。

图1 森林草莓不同发育时期花药形态

2.2 森林草莓花粉发育的形态观察

将不同发育时期的花药破碎后，其中的花粉铺展到载玻片上镜检观察，小蕾、中蕾花药中的花粉粒多为形状不规则，较小，外壁皱缩，色淡偏白（图2A）；大蕾花药中的花粉粒多数较大呈圆形，周边发育饱满，色泽较深呈黄橙色（图2B）；开花初期及开花盛期花药中的花粉粒形态与小蕾、中蕾花药中的类似。

图2 森林草莓不同发育时期花粉形态

2.3 森林草莓花粉活力测定

不同发育时期的花粉经I-KI染色后，结果显示大蕾花药中较大饱满呈圆形的花粉粒被染成深棕色至黑色，说明其发育程度好，内有淀粉粒积聚，细胞壁（花粉外壁）纹饰清晰，说明花粉具有较高活性，发育正常；另有少数花粉粒畸形，呈多角形，不着色，说明发育程度差，内含淀粉粒少。其他几个不同发育时期的形状不规则，色淡偏白的花粉粒则不着色，说明其中基本不含淀粉粒，花粉外壁发育差。

2.4 森林草莓花粉萌发测定

对不同发育时期的花粉进行萌发试验，以花粉粒从花粉管长出至大于其直径视为萌发，显微镜下观察并测量花粉管长度。结果表明，与花粉活力检测相似，大蕾时期的花粉萌发率最高，达62.57%，小蕾时期花粉萌发率最低，仅为2.34%，开花初期和中蕾时期萌发率降低至最高值的一半以下，开花盛期与小蕾时期相似，萌发率极低（表1）。

表1 不同发育时期森林草莓花粉萌发率比较

3 讨论

花粉萌发在不同的植物物种之中所需要的条件不尽相同。温度、钙离子、硼酸被认为是促进花粉萌发的重要条件[15]。栽培八倍体草莓的花粉活力和萌发条件已有比较详尽的报道。不同浓度的硼酸、蔗糖以及培养时间、培养温度对草莓花粉生活力的影响不同，通过花粉离体萌发法，筛选花粉萌发最适的固体培养基，并在最优培养基上进一步筛选适合花粉萌发的时间和温度，结果显示不同草莓品种其花粉活力各不相同[16]。此外，研究表明，育苗期药剂处理对草莓花粉活力产生影响，‘红颊’草莓育苗期施用质量浓度为 200 mg/L多效唑，加施20 mg /L赤霉素处理，可提高花粉萌发率[17]。IAA、IBA、GA3、6-KT、6-BA和NAA等植物生长调节剂对草莓花粉萌发和花粉管生长也产生影响，在一定浓度范围内，IAA、IBA、GA3、6-BA和 NAA对草莓花粉萌发和花粉管生长起促进作用，6-KT虽能促进草莓的花粉萌发，但对其花粉管生长有抑制作用；两种植物生长调节剂的混合作用效果不明显[18]。在 25 ℃的温度条件下，钙离子、硼酸、蔗糖能够促进花粉萌发和花粉管生长，而大多数农药则抑制花粉萌发[11,14]，但关于野生森林草莓花粉活性和萌发条件仍未知。

研究表明，田间自然条件下森林草莓（Fragaria vesca）Ruegen仅在小蕾期有少量具活力的花粉（16.74±3.16）%，其余各阶段均未检测到花粉活力[19-20]。课题组研究表明，在人工栽培条件下，森林草莓花粉的活力、萌发状况及花粉管生长等与花药形态、发育阶段密切相关。花药发育在花蕾时期即已开始，经历了未开花的小蕾、中蕾、大蕾和开花初期、开花盛期，逐渐发育成熟。形态观察结果表明，未开花的小蕾、中蕾、大蕾时期，花药发育呈心形，边缘规则，依稀可见其中花粉粒呈鹅黄色颗粒状，但并未散出花粉；花粉铺展后，体式显微镜下观察，各不同发育时期的花粉粒表现出形状和颜色的不同，小蕾、中蕾时期花药中的花粉粒多为形状不规则，颜色偏淡，也有少数形状饱满呈黄色的花粉粒；大蕾花药中的花粉粒多数较大呈圆形，周边形状饱满，呈黄橙色，少数较小而色淡。花药继续发育至开花期（包括前期的开花初期和后期的开花盛期），形状饱满呈黄色的花粉粒骤减，绝大多数为无色花粉粒。经I-KI染色后，只有形状饱满呈黄色的花粉粒被染成黑色，说明其发育良好，形成较多淀粉粒等营养物质，为后续花粉萌发提供必需的营养准备。此外，课题组研究还表明，森林草莓花粉的萌发状况及花粉管生长也与花药形态、发育阶段密切相关，大蕾时期花药中的圆形、周边形状饱满、黄橙色花粉粒不教。这些结果与I-KI染色后的花粉活力测定结果互相佐证，即有活力的花粉萌发效果好。与前人观察到的结果[19-20]相比较可知，森林草莓在田间栽培和人工培养箱中栽培，其花粉萌发活力和花粉活力最大的时期不尽相同，这可能与栽培条件有关，培养箱栽培可控制条件至较适宜花粉萌发；也可能与试验用森林草莓材料的来源有关，野生的森林草莓采自不同地理生态环境，造成对花粉萌发的适应性不同。此外，研究表明，野生二倍体草莓物种黄毛草莓（Fragaria nilgerrensis）花粉在开花盛期活力最大，其他时期均较低或没有活力[21]，可见，即使同为二倍体的草莓属植物，其花粉活力最大的时期也有区别。在两个不同野生二倍体和栽培八倍体草莓间杂交，杂交后代花粉生活力大不相同，但均较低。以野生二倍体绿色草莓和栽培八倍体草莓宁玉为材料进行杂交，其子代花粉萌发率仅在 20%以下[22]；而以野生二倍体森林草莓和栽培八倍体草莓‘红玉’为材料进行杂交，其子代花粉活力在大蕾期和开花第 1天达到高峰，花粉活力分别为（32.13±4.42）%和（35.92±3.61）%[20]。这些结果说明倍性差别较大的亲本杂交后代，其花粉活力不高，不宜用于授粉结实。

花粉的萌发是其活力的体现，通过组织化学染色法可以显示花粉活力，为确定花粉萌发的最佳采样时期奠定基础[23]。对蔷薇科与草莓亲缘关系相近的其他栽培物种的研究发现，吲哚乙酸、萘乙酸、赤霉素、2，4-D、6-BA等植物生长调节剂对苹果花粉萌发和花粉管生长的影响不大[24]，而蔗糖、氯化钙、硼酸、PEG-6000等常规培养基配方及培养基pH值则是包括甜樱桃、红宝石海棠、美蔷薇等许多花粉萌发的前提成功条件[25-27]。由此分析，对蔷薇科植物而言，基本萌发条件得以保证的情况下，花粉可以顺利萌发，授粉能否成功主要决定于授粉时机。本试验结果表明，大蕾期是森林草莓花粉活力最高的时候，适合测定花粉萌发率及在杂交育种中应用。提早或延迟采集花粉，花粉发育不足或过度，活力下降，不适合测定花粉萌发率和在实践中应用。授粉是产量的决定因素，但关于花粉萌发的分子机制仍不清楚，近期转录组和蛋白质组数据使得人们对花粉萌发及其调控有了新的认知，多达15个调控基因已经鉴定出来[28-29]，结合基因编辑技术应用，将大大加深对花粉萌发及其调控的认识。