膜联蛋白A家族分泌机制的研究进展

姜 玮，王 娟

（北京工业大学环境与生命学部，北京 100124）

膜联蛋白(annexin) 是一类进化保守的钙离子依赖的磷脂结合蛋白家族，广泛存在于动植物细胞中[1]。细胞分泌是原核生物和真核生物都存在的一种基本的生理过程，它将可溶的蛋白质和货物输送到细胞外。在真核生物中，大多数分泌蛋白通过常规分泌途径分泌，即从内质网运输到高尔基体，再由分泌囊泡等运输到质膜(plasma membrane，PM)[2]。除常规蛋白分泌途径外，研究发现越来越多的蛋白可以通过非常规途径分泌，如不携带信号肽的胞浆蛋白的胞外分泌、含信号肽的跨膜蛋白绕过高尔基体在细胞表面运输等[3]。膜联蛋白由于缺少信号肽，只能通过非常规分泌途径分泌。现对膜联蛋白A家族的非常规分泌途径进行综述。

1 膜联蛋白A家族

1.1 膜联蛋白A家族概述

膜联蛋白是一种钙依赖的磷脂结合蛋白，最早由Creutz等人在肾上腺细胞中分离纯化获得[4]。研究发现的1000多种膜联蛋白主要存在于脊椎动物、无脊椎动物、植物、真菌中，尚未在酵母和原核生物中发现。脊椎动物常见的12个膜联蛋白被命名为膜联蛋白A家族[5]。膜联蛋白核心区由4~8个重复序列组成，每个重复序列长约70个氨基酸，由5个ɑ螺旋组合形成圆盘结构，包含一个与钙离子结合的特征‘type2’基序[1]。由于这种保守的一级结构，膜联蛋白彼此之间具有高度的同一性。在哺乳动物中，任何一种膜联蛋白与该家族的其他成员都有40%~60%的同源性。膜联蛋白的N末端结构域包含磷酸化、蛋白质分解，甚至与其他蛋白质相互作用的主要部位，被认为是蛋白质的调节区[6]。

1.2 膜联蛋白A家族的功能

首先，膜联蛋白A家族可以促进细胞膜和细胞骨架的形成。膜联蛋白与磷脂结合后能够通过其横向聚集调节双层膜结构的形成，在此过程中，膜联蛋白作为膜骨架起到稳定脂质双层膜结构的作用[7]。研究表明，哺乳动物中的膜联蛋白A家族以钙依赖性方式与肌动蛋白微丝结合，介导肌动蛋白微丝的聚集，从而影响细胞骨架的功能[1]。其次，膜联蛋白A家族参与调节细胞信号转导。膜联蛋白A1、A2、A6、A8参与调节表皮生长因子受体(EGFR)信号传导途径[8]，且膜联蛋白A6可以通过招募GTPase激活蛋白（p120GAP）负调控EGFR信号传导通路[9]。膜联蛋白A家族也参与细胞增殖和凋亡。在急性早幼粒细胞白血病细胞中，全反式维甲酸诱导的分化与膜联蛋白A8下调有关，表明其在增殖和分化中发挥作用[10]。膜联蛋白A5是几乎所有细胞和组织中含量最丰富的膜联蛋白，大量的膜联蛋白A5在细胞外被发现，由于其对质膜外小叶中磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）的强结合亲和力，膜联蛋白A5现在被广泛用于检测各种疾病环境中的凋亡细胞[11]。

抗凝和炎症调节是膜联蛋白A家族重要的生理病理功能。膜联蛋白A4和膜联蛋白A5通过钙离子调节与磷脂结合，在细胞外发挥抗凝血因子的作用。膜联蛋白A5的血浆浓度在怀孕期间和产后都很低，且保持不变，有助于防止妊娠期间胎盘内凝血；而膜联蛋白A4的水平在分娩后不久就会增加，在预防弥漫性血管内凝血病中发挥作用[12]。膜联蛋白A1是一种糖皮质激素调节蛋白，膜联蛋白A1基因敲除小鼠白细胞迁移和IL-1β生成增加，表现出抵抗糖皮质激素的抗炎作用[13]。在急性炎症中，膜联蛋白A2与肌动蛋白和钙黏蛋白的相互作用是其调节血管完整性的基础，其可以协助启动血管生成，促进组织修复[14]。敲低膜联蛋白A3可以通过激活PI3K/AKT信号通路，促进心肌组织的修复和愈合[15]。膜联蛋白A5治疗可减轻高胆固醇血症小鼠缺血后的炎症反应，改善左室重构，改善高胆固醇血症小鼠的心功能[16]。

研究发现，膜联蛋白可以在细胞外发挥作用，但膜联蛋白是如何从胞内分泌到胞外的仍不清楚。已知膜联蛋白是可溶性细胞溶质蛋白，缺乏信号肽，因此，膜联蛋白家族只能通过非常规分泌途径分泌。

2 膜联蛋白A家族的非常规分泌途径

非常规蛋白分泌（unconventional protein secretion，UPS）途径可以分为四种：Ⅰ型为直接跨质膜转运，Ⅱ型为通过ABC（ATP-binding-cassette）转运体转运，Ⅲ型为基于细胞器的易位和细胞外小泡的分泌，IV型为有信号肽或有跨膜区域的分泌蛋白进入内质网但不经过高尔基体到达细胞质膜的分泌[17]。目前，已知的膜联蛋白的分泌途径主要为前三种，即直接跨质膜转运、通过ABC转运体转运、基于细胞器的易位和细胞外小泡的分泌。

2.1 直接跨质膜转运

直接跨质膜转运是分泌货物不需要囊泡中间体而直接跨过细胞膜分泌。膜联蛋白A6是钙离子和脂质结合蛋白家族中的一员，它在中等酸性的pH下可以穿透膜的疏水性区域，以不依赖于钙离子的方式与膜相互作用，并作为膜整合蛋白发挥作用[18]。在低pH条件下，膜联蛋白A5和膜联蛋白A12在没有钙离子的情况下，能够暴露在双层疏水结构域中形成离子通道，可逆地与磷脂囊泡结合[19]。综上所述，膜联蛋白可能不需要任何其他中间体，直接跨质膜转运。

2.2 通过ABC（ATP-binding-cassette）转运体转运

ABC转运蛋白是一种依赖于ATP的膜转运蛋白，负责运输离子、重金属、氨基酸和寡肽等货物。在哺乳动物细胞中，ABC转运蛋白也负责无信号肽蛋白的分泌。研究发现，糖皮质激素可以刺激滤泡星状细胞中膜联蛋白A1的分泌，在这个过程中观察到ABCA1转运蛋白与细胞表面的膜联蛋白A1共定位，且ABC转运蛋白抑制剂格列本脲抑制糖皮质激素诱导的膜联蛋白A1的分泌。由此说明，ABCA1在膜联蛋白A1的分泌中发挥作用[20]。

2.3 基于细胞器的易位和细胞外小泡的分泌

基于细胞器的易位和细胞外小泡的分泌，是将蛋白货物整合到膜结合的细胞器或结构中进行分泌的途径[21]。分泌形式包括微囊泡、外泌体、分泌型自噬和分泌型溶酶体等。

2.3.1 微囊泡形式分泌 微囊泡（microvesicles，MVs）是质膜向外收缩时直接从质膜上脱落的囊泡，含有非常规分泌的物质。微囊泡是细胞外小泡（extracellular vesicles，EVs）的一部分，直径在50 nm～1000 nm[22]。

Jeppesen等[23]用结构照明显微镜(SIM)观察到，膜联蛋白A1在质膜上染色较深，可直接在质膜上观察到膜联蛋白 A1阳性囊泡的萌发；膜联蛋白A1阳性囊泡的大小分布在150 nm~1000 nm之间，与经典的微囊泡大小一致，其生物发生需要从质膜上脱落，这使膜联蛋白A1成为经典微囊泡的特异性分子标记。

2.3.2 外泌体 1983年，Pan和Johnstone[24]发现外泌体（exosome），它是细胞内多泡体(multivesicular body，MVB)与细胞膜融合后释放到细胞外基质中的膜性囊泡，是一种直径为40 nm~100 nm的纳米级脂质包裹体结构，内部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物质[25]。几乎所有类型的细胞都可以产生并释放外泌体。

在细胞质中，膜联蛋白在膜转运和内吞作用中起重要作用。有研究表明，外泌体在膜联蛋白的分泌中发挥了作用。Leoni等[27]发现，内源性膜联蛋白A1定位于细胞外小泡（EV），通过免疫金标记法和电子显微镜观察到膜联蛋白A1存在于与外泌体大小和形状一致的小泡中。CD63已被报道为外泌体的一种成分，采用超速离心和琼脂糖珠亲和纯化的方法分离外泌体，通过免疫印迹法检测，在含有CD63的EVs中发现了膜联蛋白A1[26]。Pessolano等[28]利用Western印迹分析也发现膜联蛋白A1存在于细胞外泌体中，且可以通过内吞和胞吐途径与质膜融合。Maji等[29]通过免疫电子显微镜分析表明，膜联蛋白A2主要存在于外泌体的表面和管腔。Valapala等[30]研究发现，膜联蛋白A2是受离子载体刺激后细胞释放的外泌体的组成部分，在这个研究中，利用免疫印迹法证实了外泌体中含有膜联蛋白A2，且经过离子载体处理后，在外泌体标记蛋白hsc70的水平增加的同时，膜联蛋白A2的水平也增加。外泌体抑制剂DMA可以抑制干扰素-ɤ刺激增加肺上皮细胞膜联蛋白A2的细胞表面易位[31]。研究表明，膜联蛋白A5可以作为外泌体的标记蛋白[32]。Comfort等[33]利用毛细管免疫分析方法对细胞外泌体进行蛋白质定量，发现了膜联蛋白A5的存在。Raj等[34]对超速离心得到的外泌体蛋白进行iTRAQ分析也发现了膜联蛋白A5的存在。Sakwe等[35]通过免疫印迹对分泌的提取物和细胞总蛋白进行分析表明，膜联蛋白A6由乳腺癌细胞以钙离子依赖的方式通过外泌体分泌。综上所述，膜联蛋白可以通过外泌体分泌。

2.3.3 分泌型自噬 自噬是一种利用溶酶体降解失活蛋白质和细胞器的稳态过程。有研究表明，自噬可以不涉及STX17及其复合体，由几种与囊泡运输和融合有关的蛋白质，如Rab蛋白(Rab8A)和SNARES蛋白(SEC22B)，通过避免经典的自噬体-溶酶体融合来介导分泌型自噬，并驱动自噬体与细胞膜融合。自噬体也可以与MVB融合，形成amphisomes，将货物运输到膜外。

虽然自噬和囊泡运输之间的关系仍不清楚，但已知Rab蛋白参与了这两个过程，例如，Rab7和Rab11A在自噬途径和EV运输中都起作用[36]。在干扰素-ɤ的刺激下，自噬小体可与MVB融合，将膜联蛋白A2运输到外泌体。在这个途径中，膜联蛋白A2被运输到自噬小体中，自噬小体以Rab11依赖的方式与MVB融合后，以Rab8A和Rab27A依赖的方式与质膜融合。在同一项研究中，自噬相关蛋白也被证明在膜联蛋白A2感染外泌体的分泌中发挥作用，如当自噬蛋白5(ATG5)被敲低时，外泌体中的膜联蛋白A2分泌减少[37]。综上所述，干扰素-ɤ刺激可以诱导分泌型自噬增加细胞表面膜联蛋白A2的数量。

2.3.4 分泌型溶酶体 分泌型溶酶体是一类能够对外界刺激进行调节分泌的溶酶体。有研究表明，前列腺体是通过分泌型溶酶体与质膜融合释放到膜外的。前列腺体是由前列腺上皮细胞分泌的小泡，其中包括了膜联蛋白A2[38]。由于没有相关证据表明阻断分泌型溶酶体途径后，膜联蛋白A2的分泌是否会发生变化，所以，尚不确定膜联蛋白A2单蛋白是否可以通过分泌型溶酶体途径运输到膜外。

3 结语

自1978年Creutz等人发现膜联蛋白以来，到现在已经将近50年了，其功能也被大家逐渐发现，然而，作为一种非常规分泌蛋白，膜联蛋白的分泌模式尚未被完全认知。虽然已经了解了几种膜联蛋白A家族的非常规分泌机制，包括直接跨质膜运输、通过细胞外囊泡运输以及通过分泌型自噬体等途径，但仍有些问题亟待解决，如哪些刺激可以促进或抑制膜联蛋白的分泌，膜联蛋白直接跨质膜运输是否需要特定的环境，在没有干扰素-ɤ刺激的情况下，膜联蛋白A2还能否通过分泌型自噬途径分泌等。这些问题的解决将有助于更好地了解膜联蛋白家族的分泌机制，对相关疾病的治疗也将具有重要的现实意义和价值。