非小细胞肺癌中循环肿瘤细胞基因检测及免疫标志物研究进展

刘应通 李道俊

三峡大学第一临床医学院 湖北省宜昌市中心人民医院肿瘤科，湖北宜昌 443003

2020年全球肺癌发病率约为11.4%，病死率为18.0%，已成为恶性肿瘤致死的首要原因[1]。在肺癌的分型中，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占肺癌总数的85%[2]。对于肺癌的诊断，病理学相关检查仍是金标准；然而，肿瘤活检是侵入性操作，患者因获取组织存在高风险，无法获得肿瘤组织。此外，肿瘤具有时间及空间的异质性，在某一部位及某一时间段获取的肿瘤组织上的信息并不能完全表征肿瘤的信息，故而肿瘤间和肿瘤内异质性对指导临床决策带来了挑战。基于此，液体活检目前正受到关注，因为它具有非侵入性、快速、实时应用等优点，其一系列的研究正在进行中。液体活检指通过对血液样品等非固体生物组织的采集，检测生物标志物，完善肿瘤分子分型、为治疗方案的制订提供相关信息。目前，液体活检的生物标志物主要包括循环肿瘤细胞（circulating tumour cells，CTC）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs，主要是外泌体）、循环无细胞RNA（cfRNA）。其中，CTC是液体活检的重要组成部分[3]。CTC的概念由澳大利亚病理学家Ashworth在1869年第一次提出[4]，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段。与传统的影像学、内窥镜检查以及病理学诊断相比，可敏感地监测疾病的变化，迅速地评价某一治疗方案的效果。通过血液循环扩散肿瘤细胞是癌症转移重要的中间步骤，当单个细胞或癌细胞团具备分离并远离原发肿瘤、通过周围组织迁移并进入淋巴系统和血液循环的能力时，肿瘤的转移性就变得明显，这些细胞即是CTC[5-6]。CTC上行转录组学及相关标记物的测定，可以提供转移和复发的早期预警及疗效监测，CTC测定能够监测癌症进展、复发及其治疗反应等。本文对临床中常见的NSCLC突变基因及免疫标志物在CTC中的表达及研究进行综述。

1 表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）

对于具有驱动基因阳性的晚期NSCLC患者而言，目前靶向治疗为一线首选治疗，在靶向治疗之前，需通过基因检测明确靶向位点突变，EGFR为NSCLC中最常见的突变靶点，约占NSCLC患者的33.3%[7]。EGFR检测方法众多，有检测EGFR蛋白表达水平的免疫组织化学法，还有检测EGFR基因突变的DNA直接测序法、聚合酶链反应等，而检测样本国内外目前推荐组织样本，认为其检测的敏感度和特异度比其他类型的样本高，是EGFR检测的金标准。对于无法获取组织样本或样本量不够的晚期NSCLC患者，CTC上行EGFR分析也成为了一种选择。对CTC行单细胞全基因组测序目前已有相关研究完成，其中第一个全基因组分析发表于2012年，并发现在单个CTC中检测到的单核苷酸变异（single nucleotide variants，SNV）具有高度异质性[8]，与药物靶标（如EGFR）、耐药性（PIK3CA）和表型转变（TP53、RB1）相关的重要突变都可以在CTC中检测到，从而揭示CTC基因组分析的重要临床价值。对于CTC中的EGFR检测，近年来也得到了进一步的研究。有研究[9]通过下一代测序对37个富含CTC的患者行EGFR分析，结果发现在检查样本中发现了EGFR突变，并且包含了所有目前临床中常见的突变类型，通过进一步将CTC上的EGFR检测分析与组织EGFR分析对比，发现CTC与组织中的EGFR突变率具有一致性，这一点在EGFR 19外显子缺失突变中更为显著。Turetta等[10]也通过ddPCR的方法检测了CTC中EGFR突变情况，发现在85%的患者CTC中有着与组织基因检测的一致性，并发现在组织检测EGFR野生型的一部分患者也可以从CTC中检出EGFR突变。尽管表皮生长因子受体的酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）为NSCLC患者带来了巨大的临床获益，但其在治疗过程中仍然会产生耐药，T790M突变是EGFR-TKI耐药的常见机制，因此对于EGFR-TKI耐药的患者T790M的检测变得至关重要，Sundaresan等[11]通过对40例EGFRTKI治疗进展的EGFR突变的患者再次活检组织的T790M基因型检测及CTC的检测进行了比较，发现在肿瘤活检组织、CTC样本和ctDNA样本中成功获得了T790M基因型，使用每种基因分型测定法在47%～50%的患者中检测到耐药相关突变，其一致性范围为57%～74%。虽然基于CTC和ctDNA的基因分型在20%～30%的病例中存在差异，但对于多数患者，这两种检测方法的互补性使所有患者的基因分型、精准治疗成为可能。

2 间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）

ALK基因突变是NSCLC患者中常见的另一个突变靶点，其突变率在1%～7%，并且有ALK基因突变的患者较少伴随EGFR及KRAS基因的突变[12-15]。根据NCCN指南，对于ALK阳性的晚期NSCLC患者，一线推荐使用分子靶向药物克唑替尼等ALK酪氨酸激酶抑制剂治疗。对于ALK基因重排的检测，目前最常用的是免疫荧光杂交技术（FISH），这种方法同样具有异质性，小活检标本与切除标本ALK基因重排的一致性并不一致。Ilie等[16]最先对CTC上ALK基因重排进行了分析，他们通过免疫组织化学染色，发现研究的46例患者中有5例肺腺癌患者ALK阳性，后续行FISH分析证实了具有ALK基因重排，在这5例患者中均检测出了CTC，并且CTC-ALK呈阳性，在CTC中分析ALK基因重排的可行性，在后续的Tan等[17]的研究中也得到了证实。但是，FISH检测ALK基因重排与CTC-ALK检测重排并非具有完全一致性，少数经FISH检测为ALK阴性的患者，其外周血CTC中ALK基因检测具有突变[18]。CTC行ALK基因测序可以提供一种独特的方法来评估患者突变情况，为部分无法获取组织的患者提供了另一种基因检测方法，可能有助于发现用药疗效及异质性耐药的机制。

3 程序性死亡受体配体-1（programmed death receptor ligand-1，PD-L1）

免疫检查点抑制剂为晚期NSCLC患者带来了获益，尤其是对于PD-L1高表达即肿瘤细胞阳性比例分数（tumor proportion score，TPS）≥ 50% 的患者，免疫检查点抑制剂可显著延长患者无疾病进展生存期（progression-free survival，PFS），且治疗过程中总体不良反应发生率更低[19-20]，基于此，对于PD-L1高表达，驱动基因阴性的晚期NSCLC患者，因此将免疫检查点抑制剂纳入了一线治疗。并且发现PD-L1的表达水平可作为免疫治疗疗效的预测因素，对于PD-L1的检测，往往通过免疫组织化学的方法进行，对患者的组织样本量要求较高，并且不便于多次取样检测、动态评估，而CTC-PD-L1的检测便可克服此项困难。通过既往的研究，CTCPD-L1的表达分析具有可行性，Chen等[21]通过收集51例NSCLC患者外周血行CTC检测并对CTC进行PD-L1分析，结果发现，有28例（67%）患者的CTC中可见PD-L1表达，这项研究同时对患者的组织通过22C3抗体行PD-L1免疫组织化学染色，通过与CTC-PD-L1对比，两者之间具有80%的一致性。然而这项研究并未对CTC-PD-L1进行动态检测，并且纳入的患者基线特征并不统一。Guibert等[22]纳入了96例晚期NSCLC患者，并在纳武利尤单抗治疗前和进展时收集血液样本，在CTC上动态评估PD-L1的表达水平，结果发现，在基线时，便在大部分患者的CTC中检测出了PD-L1的表达，通过后续使用纳武利尤单抗治疗进展之后行CTC-PD-L1分析，发现治疗前CTC高负荷与预后不良相关，但PD-L1在CTC上的表达没有显著的预后影响。与Chen等[21]的研究一样，这项研究也进行了组织PD-L1的检测，不同于Chen等的研究，其CTC-PD-L1与组织PD-L1之间的一致性仅为45.4%，两者之间并没有统计学差异。在前几项的研究中，行CTC检测均使用的是患者的外周静脉血，Dong等[23]则采取患者的外周动脉血及肺静脉血行CTC及CTC-PD-L1分析，结果发现肺静脉血中CTC的检测阳性率显著高于外周静脉血，并且肺静脉抽血的方法可能会提高PD-L1在CTC中的检测效率。综上所述，CTC-PD-L1检测具有可行性，但是其检测结果与组织学PD-L1检测结果之间的一致性仍待商榷，并且目前CTC及PD-L1的检测方法并没有统一的标准，所以CTC-PD-L1为免疫治疗的预后指标仍需大型的临床试验进一步佐证。

4 肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）

TMB可能是免疫治疗（ICS）疗效的另一个预测因素，CheckMate 026试验在一线NSCLC治疗中比较了PD-L1≥5%的患者纳武利尤单抗组与化疗组疗效及安全性分析，在基于TMB的探索性亚组分析中，与化疗相比，在TMB高的肿瘤中，纳武利尤单抗报告了更高的客观缓解率（objective response rate，ORR）和更长的 PFS[24]。同样，TMB被用作PFS的前瞻性生物标志物，作为CheckMate 227研究中的两个共同主要终点之一，该研究将纳武利尤单抗和伊匹木单抗的组合与铂类化疗进行了比较。在基于组织活检的TMB高的患者组中（tTMB，定义为每兆碱基≥10个突变），其PFS及ORR较化疗组相比具有显著获益[25]。目前尚不清楚在CTC中行TMB的检测是否与ICI的临床结果相关。但是，既往的研究已经评估来了血液TMB（bTMB）在晚期NSCLC中的预测价值的研究。据报道，由NGS确定的bTMB与使用全外显子组测序的tTMB相关[26-27]。在对POPLAR和OAK临床研究的回顾性探索性分析中，证明了具有高bTMB（≥16 Mut/Mb）的患者与更好的结果预后相关[28]。目前给予血液的TMB检测已有多项临床试验正在开展，但CTC中的TMB检测需要进一步研究，CTC或将成为TMB研究的新焦点，因为它们允许对肿瘤表型进行结构评估和分子表征。

5 总结

CTC的发现极大地改变了传统的医学模式，其标本采集方便、可动态检测极大地方便了临床，目前CTC可用于早期疾病检测、预后、复发监测和个性化癌症治疗。CTC单细胞测序及免疫标志物的测定可以获得癌症患者CTC全基因组拷贝数变化规律及免疫标志物的转归情况，为我们鉴定癌种亚型，进一步揭示肿瘤转移和克隆起源的分子机制。此外，CTC的单细胞测序能够识别癌基因中的点突变，揭示接受癌症治疗的患者基因突变的动态变化，并预测耐药性和表型转化，最终提供真正个性化的医疗方法。液体活检和无创分析无疑将继续在NSCLC患者的整体评估和治疗中发挥重要作用。但CTC行单细胞基因测序即免疫标志物检测与临床现在常用的组织检测结果并不完全一致，两者谁更能代表肿瘤的特性目前并无统一的定论。需要进一步的大样本研究，CTC上动态监测基因靶向位点突变情况及免疫标志物的变化有望成为NSCLC诊断和治疗中不可或缺的常规评估方法。