一起放牧羊群布鲁氏菌病的分析检测

金肖叶,叶 锋,刘丽娅,马晓菁,李 鑫,舒 展,陈 卓,钟 旗

(1.新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐 830052;2.新疆畜牧科学院兽医研究所,乌鲁木齐 830000;3.新疆阿勒泰地区动物疾控中心,新疆阿勒泰 836500)

0 引 言

【研究意义】布鲁氏菌病(Brucellosis),是由布鲁氏菌(Brucella)感染引起的一种以流产和发热为特征的人畜共患传染病[1-3],其为多种动物共患的二类动物疫病[4-5]。新疆是我国四大牧区之一[6-7]。通过流产羊群所在场圈舍布局、周边环境、畜间分布等信息进行追溯与追踪,对分析布病发病原因及传染源有重要意义。【前人研究进展】布病常用的诊断方法有两类,一类是病原分离鉴定或聚合酶链反应试验(Polymerase Chain Reaction,PCR)等分子生物学方法[8],另一类是血清学诊断方法。Bricker等[9]开发的具有高灵敏度和特异性的聚合酶链反应是最早用于布病检测的PCR方法。布病血清学检测方法种类较多,因其操作简单、快速、特异性高常用于临床样品检测,主要有虎红平板凝集试验(Tiger red plate agglutination test,RBT)[10]、胶体金试纸条(Gold immunochromatographic assay,GICA)[11]、试管凝集试验(Standard tube agglutination test,SAT)[12]、微量凝集检测方法(Micro agglutination Test,MAT)[13]、间接酶联免疫吸附试验(Indirect enzyme-linked immunosorbent assay,iELISA)[14]、竞争酶联免疫吸附试验(Competitive enzyme-linked immunosorbent assay,cELISA)[15-16]和荧光偏振检测技术(Fluorescence polarization assay,FPA)[17]等。【本研究切入点】国家标准《动物布鲁氏菌病诊断技术》(GB/T18646-2018)规定布病的初筛方法是RBT和iELISA,确诊方法是SAT、MAT、cELISA,PCR。需研究应用RBT、GICA、SAT、MAT、FPA、iELISA、cELISA和PCR等8种方法,对放牧流产羊群进行布病检测。【拟解决的关键问题】依据检测结果,分析布病8种诊断方法的适用性,从养殖模式、年龄和性别等因素分析布病的流行风险因素,为放牧羊群布病的诊断防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 羊 只

2020年6月调查流产羊群所在场及周边区域环境羊只养殖和布病监测及流产羊群的饲养管理、免疫、羊只流动及流产、死胎情况。

流产羊群所在场羊总存栏数为670只,其中成年羊590只,断奶羔羊80只。

采集未经布病疫苗免疫的放牧流产羊群血清和抗凝血,按照置信区间可接受误差5%的比例进行采样[18],其中种公羊、后备公羊、年度有流产史的母羊血样必采;每只羊采集全血和抗凝血3 mL。共采集3～5周岁成年羊血50份,3月龄羔羊血40份。

1.1.2 试 剂

RBT抗原、SAT抗原、布鲁氏菌国家标准阳性血清与布鲁氏菌国家标准阴性血清均购自哈药集团生物疫苗有限公司;RBT抗原、SAT抗原、MAT抗原均购自中国兽医药品监察所;布鲁氏菌病抗体快速检测卡(简称胶体金检测卡,GICA)购自韩国安捷Bionote公司;cELISA与iELISA试剂盒购自北京维德维康生物技术有限公司;FPA试剂盒购自哈尔滨平河生物技术有限公司;布鲁氏菌病VirB8-PCR诊断试剂盒购自新疆畜牧科学院兽医研究所。

1.2 方 法

使用RBT、GICA、SAT、MAT、cELISA、iELISA、FPA和RCR方法,对所采集的样品进行布病检测。表1

表1 检测结果Table 1 Possible results of test

1.3 数据处理

研究选用敏感性、特异性、假阴性率、假阳性率、一致率和Kappa值6种分析指标对检测结果进行分析[19],并用SPSS21.0统计软件对数据进行统计分析。

符合率=[(a+d)/n]×100%;敏感性=(a/e1)×100%;特异性=(d/e2)×100%;假阴性率=(c/e1)×100%;假阳性率=(b/e2)×100%;

Kappa值={[(a+d)/n]-[(e1r1+e2r2/n2]}/{1-[(e1r1+e2r2)/n2]}。

Kappa系数<0,一致性极差;Kappa系数为0～0.2,一致性微弱;Kappa系数为0.21～0.4,一致性弱;Kappa系数为0.41～0.6,一致性中度;Kappa系数为0.61～0.8,一致性高度;Kappa为0.81～1.0,一致性极强。

2 结果与分析

2.1 样品检测结果

2.1.1 不同诊断方法检测羊血清阳性率

研究表明,初筛方法中iELISA检出阳性率最高为25.56%,RBT检出阳性率最低为8.89%。确诊方法中cELISA检出阳性率最高为24.44%,MAT检出阳性率最低为14.44%。平均感染率为17.78%。表2

表2 不同诊断方法检测羊血清阳性率Table 2 Results of different diagnostic methods

2.1.2 部分血清样品布鲁氏菌PCR检测

研究表明,14份样品PCR产物扩增出720 bp条带,可确定为布病阳性样品。图1

注:M.DL2000 marker;1～14.部分血清样品

2.2 检测结果

2.2.1 血清学初筛方法的比较

研究表明,RBT阳性数均为8份,SAT阳性数均为16份,初筛方法以RBT检测结果为对照,确诊方法以SAT检测结果为对照。

2.2.2 血清学初筛方法的Kappa值评价

研究表明,4种血清学初筛方法RBT、GICA、FPA和iELISA,敏感性均为100%,特异性RBT与GICA的特异性(96.34%)高于与FPA、iELISA的特异性(86.59%、81.71%)。RBT与GICA的一致性极强(Kappa=0.824)2种方法有较高的符合率(96.67%);iELISA与RBT、GICA、FPA的一致性中等(Kappa=0.443、0.577、0.628)符合率一般(83.33%、86.66%、86.67%)。表3,表4

表3 血清学初筛方法的比较(n=90)Table 3 Comparison of primary screening methods in serology(n=90)

表4 血清学初筛方法的Kappa值评价Table 4 The Kappavalue evaluation of the preliminary screening method in serology

2.2.3 血清学确诊方法的比较

研究表明,SAT与cELISA的敏感性较高(93.75%)与MAT的敏感性(56.25%)较低,SAT与MAT、cELISA的特异性(94.59%、87.84%)较好。SAT与MAT、cELISA为中度一致性(Kappa=0.549、0.602)符合率一般,均有假阳性和假阴性。表5、表6

表6 血清学确诊方法的Kappa值评价Table 6 Kappavalue evaluation of serological diagnostic methods

2.2.4 血清样本

研究表明,母畜阳性感染率(29.68%)大于公畜阳性感染率(11.54%)。成年羊阳性感染率(42%)大于羔羊阳性感染率(2.5%)。 表7,表8

表7 不同性别羊只布鲁氏菌病血清学 确诊方法比较Table 7 Results of serological diagnosis of brucellosis in sheep by sex

表8 不同成长阶段羊只布鲁氏菌病 血清学确诊方法比较Table 8 Results of serological diagnosis of brucellosis in different stages of growth

3 讨 论

随着家畜饲养量的不断增加,动物及其产品的流通频繁,部分地区布病发病率呈持续上升势头[20]。家畜易感布病的重要影响和养殖区域、年龄、性别、饲养方式、畜群规模及流产史等有关[21],家畜年龄是布病感染的潜在影响因素[22]。研究调查发现,成年羊的布病阳性率明显高于羔羊(成年羊42%>断奶羔羊2.5%),母畜阳性率高于公畜(母畜29.68%>公畜11.54%),有流产史的羊群患布病的风险更高。受季节和草场限制,新疆牧区牛羊养殖模式多为冬季全程舍饲,夏秋际集中放牧,也是造成布病区域性传播的主要原因。应选择适合当地的养殖模式,杜绝混牧,及时淘汰高龄家畜,最大程度降低家畜的感染风险[23]。

消除布病是一个系统而复杂的过程[24-25]。需加强检疫、自繁自养,引进种畜或补充畜群时要严格检疫[26]。

常用的布病检测方法RBT、GICA、iELISA和FPA操作简单[27-28],反应时间短,可用作初筛,但试验容易受温度的影响;SAT、MAT和cELISA可用作确诊,但SAT操作复杂、费时,结果判断受主观因素影响[29];MAT操作简便、成本低但也容易受主观因素的影响[30];cELISA方法具有特异性高、敏感性强、操作简单等优点,但是实验试剂昂贵、需要特定的仪器[31-32]。目前分子生物学检测技术已广泛应用于布鲁氏菌的检测,PCR方法以其快速、准确、高效性已成为布病高效检测方法之一[33-35]。在布病的日常监测中,面对不同区域、不同畜群、不同的免疫情况,多种血清学方法套用可提高检测结果的全面性,再结合PCR检测技术,经过多方法确诊,更能确保检测的准确性。

4 结 论

牲畜的养殖区域、养殖模式、年龄及性别都影响着羊布病的发生、发展。放牧羊群布病阳性率随年龄增加呈上升趋势(成年羊42%>断奶羔羊2.5%);雌性羊布病阳性率高于雄性(雌性29.68%>雄性11.54%),有流产史的羊群患布病的风险更高,成年雌性羊更易感染布鲁氏菌。采用RBT、GICA、iELISA或FPA等方法进行初筛,再用SAT、MAT或cELISA、PCR等方法进行确诊。

InvestigationofGrazingSheepBrucellosisand