细述基因表达载体的构建过程——由一道江苏高考题引发的思考

何志恒

(湖北省武汉市第十二中学)

基因工程中构建基因表达载体时单酶切、双酶切、PCR技术与琼脂糖凝胶电泳是教学难点,在习题中也常出现错误,本文将通过琼脂糖凝胶电泳在双酶切产物分离中的作用对其进行分析。

1.背景知识,追根溯源

在使用单酶切的载体或者平端载体时,载体本身的两个DNA末端可以匹配,产生自身连接的产物。如果载体浓度和插入DNA片段浓度均较低,则载体DNA两个末端之间碰撞的机会大于和目的DNA末端碰撞的机会,就会导致载体DNA分子的自身连接,形成环化的载体分子。

在将目的基因片段插入到载体中的时候,由于酶切位点序列的回文特征,若使用单个限制性酶切位点进行克隆,目的片段插入的方式将会有正向和反向两种,并且在将目的片段与载体片段连接的时候,载体片段将会发生较高程度的自连,从而降低克隆载体构建的成功率。

可见,导致目的基因环化、载体自身环化、目的基因与载体反向连接的原因是使用单酶切导致目的DNA和载体DNA的两端只有一种黏性末端,或者酶切后的末端为平末端。

使用两种限制酶切割即可避免目的基因、载体的错误连接。例如图1和2中要切割目的基因,若使用BamHⅠ和BgtⅡ这两种限制酶,BamHⅠ和BgtⅡ都可切出序列-GATC-的黏性末端,可以互补配对,因此用BamHⅠ和BgtⅡ同时切割目的基因不能防止酶切后含目的基因的DNA片段自身连成环状。因此,应该选切出的黏性末端不同的两种限制酶。

图1

图2

用两种能切出不同黏性末端的限制酶切割质粒后,仍然有微量质粒只被一种限制酶切割,原因可能是反应时间太短,若时间允许,可将PCR产物的限制性酶酶切时间延长到16h以上,以保证酶切完全。

用两种能产生不同黏性末端的限制酶切割后的质粒和目的基因进行连接反应,为避免产生目的基因、载体的错误连接,要先将双酶切后的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳分离,选出可用于连接反应的DNA条带,淘汰不能用于连接反应的DNA条带,再进行连接反应,避免目的基因、载体错误连接。

因此,对目的基因所在DNA、质粒用双酶切,再进行连接反应,可得到正确的连接产物。在转化时,转化效率并不是100%,可能产生两种受体细胞,一种是含重组质粒的细胞,一种是不含重组质粒的受体细胞。不含重组质粒的受体细胞中既不含重组质粒,也不含质粒,也不含环化的目的基因。

2.例题分析,修正错误

用能产生不同黏性末端的限制酶切后得到的是很多种连接产物,还是一种正确的连接产物,在习题中多次出现。下面笔者以三道题为例,分析酶切后的连接产物。

【例题1】(2019·江苏卷·33)图3是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图,载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题:

图3

(1)EcoR V酶切位点为…GAT↓ATC…

…CTA↑TAG…＇

EcoR V酶切出来的线性载体P1为________末端。

(2)用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段,其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理,在两端各添加了一个碱基为________的脱氧核苷酸,形成P2;P2和目的基因片段在________酶作用下,形成重组质粒P3。

(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板进行筛选,得到A、B、C三类菌落,其生长情况如表(“+”代表生长,“-”代表不生长)。根据表中结果判断,应选择的菌落是________(填表中字母)类,另外两类菌落质粒导入情况分别是________、________。

表1

(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图4所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段,原因是________。

图4

【参考答案】(1)平 (2)胸腺嘧啶(T) DNA连接 (3)B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒 (4)乙丙 目的基因反向连接

【补充说明及分析】如何使目的基因两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸,质粒的两端各自带有一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸?可以用末端脱氧核苷酸转移酶给质粒、目的基因两端添加一个脱氧核苷酸。反应完成后,会有部分质粒、目的基因没有被添加上脱氧核苷酸。

能否分离出含有平末端(未添加成功)的质粒、目的基因呢?利用琼脂糖凝胶电泳能分离的DNA的长度是有限的,双链DNA分子在凝胶中的迁移速率与其碱基对数目的常用对数成反比,上述两类DNA片段只相差一个碱基对,很难用琼脂糖凝胶电泳分离开。因此即使进行琼脂糖凝胶电泳,也很难分离出平末端的质粒、目的基因。

因此再用DNA连接酶进行连接反应后,就会出现平末端的质粒(P1)、目的基因环化的情况,其中P1重新环化为P0。

由于目的基因的两端是碱基为A的脱氧核苷酸,处理后质粒的两端是碱基为T的脱氧核苷酸,进行连接反应时,目的基因和质粒能够正向连接、也能反向连接。因此,转化后的受体细胞有四种:未转化的、含重组质粒(P3)的、含质粒的(P0)、含环化目的基因的。因此,只能在含四环素培养基上生长的是含重组质粒(P3)的受体菌,能在含四环素和青霉素培养基上生长的是含质粒P0的受体菌,不能在含四环素培养基上生长的是未转化的受体菌和含环化目的基因的受体菌。

通过PCR技术扩增、琼脂糖凝胶电泳就能区分目的基因和质粒的正向连接产物、反向连接产物。如果是正向连接,扩增出的片段长度最长为350 bp,如果是反向连接,扩增出的片段长度最长为400 bp。

这道高考题很好地体现了PCR技术、琼脂糖凝胶电泳技术在区分DNA连接产物中所起的作用,符合《课程标准》命题建议里提到的“科学性、规范性,要能够区分出不同素养水平的学生”。但是题目中没有详细说明目的基因和载体连接时出现错误连接的原因:琼脂糖凝胶电泳能分离的DNA长度是有限的,两个DNA片段只相差一个碱基对,很难用琼脂糖凝胶电泳分离开。这就导致教辅资料在模仿高考题出题时出现错误,如例题2。

【例题2】研究人员用图5中质粒和图6中含目的基因的片段构建重组质粒(图中标注了相关限制酶切割位点),将重组质粒导入大肠杆菌后进行筛选及PCR鉴定。以下叙述不正确的是

( )

图5

图6

A.构建重组质粒的过程应选用BclⅠ和HindⅢ两种限制酶

B.使用DNA连接酶将酶切后的质粒和目的基因片段进行重组

C.能在添加四环素的培养基上生存一定是含有重组质粒的大肠杆菌

D.利用PCR鉴定含目的基因的大肠杆菌时应选用引物甲和引物丙

【答案】C

【分析】本题选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点,但BamHⅠ会使质粒中的标记基因都被破坏,因此只能选BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割,BclⅠ和HindⅢ两种限制酶的识别序列不同,切割后产生的黏性末端也不同。据前文所述,在酶切反应时间充足的条件下,切割后进行琼脂糖凝胶电泳回收切割产物,由于质粒和目的基因所在DNA被切割后产生的DNA片段长度有明显差异,琼脂糖凝胶电泳能将需要的片段筛选出来。再用DNA连接酶进行连接反应,则连接产物只有质粒和目的基因正确连接一种。该重组质粒只有四环素抗性基因是正常的,氨苄青霉素抗性基因因插入了目的基因而失活。因此转化后的大肠杆菌有两种类型:未转化的、含重组质粒的。未转化的大肠杆菌没有四环素抗性基因,不能在添加四环素的培养基上生存,含重组质粒的大肠杆菌有四环素抗性基因,能在添加四环素的培养基上生存。从这个角度分析,C选项是正确的。

但此题没有给出“酶切反应时间充足”这个条件,高中生物学教材也没有提到:在酶切反应后先进行琼脂糖凝胶电泳回收产物,再用DNA连接酶进行连接反应,得到的连接产物就是正确的。不了解这个过程,不理解其中的原理,做这一类题往往稀里糊涂的被动接受。可将此题题干条件补充为“酶切反应时间充足,并用琼脂糖凝胶电泳分离出所需DNA片段后,再进行连接反应的条件下”,C选项修改为“能在添加四环素的培养基上生存的不一定是含重组质粒的大肠杆菌”,C选项才能作为此题的答案。与此题出现的错误类似的题有很多,例如例题3。

【例题3】运用转基因技术,将奶牛细胞中编码凝乳酶的基因转移到大肠杆菌细胞中,以达到大规模生产凝乳酶的目的。图7表示用作载体的质粒和目的基因所在DNA片段。下列操作与实验目的不符的是

( )

图7

A.用限制酶BamHⅠ、PstⅠ和DNA连接酶构建基因的表达载体

B.用含氨苄青霉素的培养基筛选出的即为导入目的基因的细菌

C.可用PCR技术大量扩增目的基因

D.用Ca2+处理大肠杆菌使其易于转化

【答案】B

【分析】据前文所述,只能用BamHⅠ、PstⅠ切割。用双酶切法产生的质粒、目的基因片段,酶切反应时间充足的条件下,经过琼脂糖凝胶电泳后,分离出所需的DNA片段再用DNA连接酶进行连接反应,得到的应该只有质粒和目的基因的正确连接产物,含有氨苄青霉素抗性基因。转化后大肠杆菌的种类有两种,一种是不含重组质粒的,即只有大肠杆菌本身的DNA,一种是含重组质粒的。因此能在含氨苄青霉素的培养基上生长的即为导入目的基因的大肠杆菌,B选项应该是正确的。此题需要补充“酶切反应时间充足,并用琼脂糖凝胶电泳分离出所需DNA片段后,再进行连接反应”,此题的B选项可修改为“用含氨苄青霉素的培养基筛选出的不一定为导入目的基因的细菌”,这样B选项才能作为此题的答案。