槲皮素及其衍生物抗植物病毒的初步研究

吴 双，薛 伟，王德炉，李春萍，陈 卓*

（1.贵州大学绿色农药与农业生物工程教育部重点实验室，贵阳 550025；2.贵州大学林学院，贵阳 550025；3.中华人民共和国贵阳海关综合技术中心，贵阳 550002）

植物病毒是一类可侵染植物的微生物，由植物病毒导致的农作物病害难控制，对产量损失大，危害重。因此，植物病毒病又称为植物癌症。采用抗植物病毒剂是防治植物病毒病的一种主要防控措施。基于传统的研究，我们从作用机理的角度将抗植物病毒剂划分为病毒抑制剂、病毒钝化剂、寄主诱导保护剂[1]。例如，娃儿藤碱（Tylophorine）作为病毒抑制剂，作用于烟草花叶病毒（TMV）RNA起始碱基发夹处，干扰病毒基因组和外壳蛋白的组装，影响病毒的复制[2]。宁南霉素（Ningnanmycin）作为病毒钝化剂，对病毒粒子的结构具有破坏作用[1]。苯并噻二唑（BTH）、毒氟磷（Dufulin）作为诱导保护剂，可激活植物寄主水杨酸信号通路，使寄主产生系统性获得性抗性（SAR），从而抑制病毒的增殖[3-4]。

槲皮素（Quercetin），化学名为3,3',4',5,7-五羟基黄酮，是一种黄酮类物质，广泛存在于植物的叶、花和果实中[5]。槲皮素在医学中有广泛的用途，具有抗癌、降血压、抗病毒活性[6-8]。槲皮素对马疱疹病毒Ⅰ型等动物病毒也具有抑制活性[9]。也有研究表明，槲皮素对多种植物病毒具有抑制活性[10-17]。因此，关于槲皮素对植物病毒的抑制活性及其作用机理值得研究。本文以槲皮素及其衍生物为研究对象，评价其对烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、马铃薯Y病毒（PVY）和水稻条纹病毒（RSV）的抑制活性，并研究槲皮素及其衍生物对本氏烟热休克蛋白（Hsp）mRNA表达的影响，以期为创制作用机制新颖的高活性抗植物病毒剂提供思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料

TMV、CMV和PVY保存于普通烟‘K326’（Nicotiana tabacumL.cv.K326）中，RSV保存于常规水稻品种上。普通烟‘K326’、本氏烟（Nicotiana benthamiana）、心叶烟（Nicotiana glutinosa）和苋色藜（Chenopodium amaranticolor）种植于本实验室的智能温室。

1.1.2 供试药剂

槲皮素、3-O-甲基槲皮素、5-O-甲基槲皮素、3,7-Di-O-甲基槲皮素、3,7,4＇-Tri-O-甲基槲皮素、3,4＇-Di-O-甲基槲皮素、7,4＇-Di-O-甲基槲皮素、6-羟基-槲皮素、3,7,3＇,4＇-Tetra-O-甲基槲皮素、7-O-甲基槲皮素、3,3-Di-OSO3H-槲 皮 素、3,7,4＇-Tri-OSO3H-槲 皮素、3＇-O-甲基-6-氢-槲皮素（纯度≥90%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亚砜（DMSO），生工生物工程（上海）股份有限公司；检测PVY的ELISA试剂盒，上海研谨生物科技有限公司；RNA提取、逆转录反应、荧光定量PCR分别采用的TransZol（目录号：ET101-01）、TransScript Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)（目录号：AU341-02）和PerfectStart Fast Green qPCR SuperMix（目录号：AQ611-01）试剂，北京全式金生物技术股份有限公司。

1.1.3 供试仪器

Quant Studio 6 Flex荧光定量PCR仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；HBS-1096C酶标仪，南京德铁生物科技有限公司。

1.2 抗植物病毒活性测试

TMV、CMV和PVY保存在烟草‘K326’上。TMV的纯化采用Gooding等[18]报道的方法，CMV的纯化采用周雪平等[19]报道的方法，PVY的纯化采用罗亮指[20]的方法，RSV的纯化采用戈林泉等[21]报道的方法。TMV和RSV的抗病毒活性评价采用半叶枯斑法在心叶烟上完成[22-23]，CMV和PVY的抗病毒活性评价采用半叶枯斑法在苋色藜上完成[20,24]。心叶烟和苋色藜种植于智能温室，白天和黑夜温度分别为25℃和20℃；光周期L∥D=16 h∥8 h，湿度控制在70%～80%。6叶期的心叶烟和苋色藜用于抗病毒活性测试。采用金刚砂磨擦接种病毒至2片叶上。将待测化合物溶解于80 μL DMSO，加入含0.1% tween 80的二次蒸馏水，定容至100 μmol/L。采用细软的毛笔将待测化合物刷在右半叶上，左半叶仅刷含0.1%tween 80的水作为对照。每个处理15个重复，独立重复3次试验。抗病毒活性按式（1）计算。

式中：X代表抑制率，%；A代表右半叶上的枯斑数；ACK代表左半叶上的枯斑数。

1.3 槲皮素对Hsp mRNA表达的影响

槲皮素对HspmRNA表达影响的分析在本氏烟上完成。本氏烟种植于智能温室，白天与黑夜温度分别为25℃和20℃，光周期L∥D=16 h∥8 h，湿度控制在70%～80%。叶龄为3叶期，采用RT-qPCR研究Hsp70和Hsp90mRNAs的表达。采用Primer 3软件（https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）设计上述基因的荧光定量PCR引物，选择actin为内参基因（表1）。槲皮素的作用剂量为125、250、500 μmol/L和1 000 μmol/L，采用42℃的高温热激本氏烟1 h，叶面喷施槲皮素后继续在42℃的高温条件下热激1 h。收集本氏烟第3叶，液氮条件下研磨成细粉。采用TransZol试剂提取总RNA，采用TransScript Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR试剂合成cDNA，采用荧光定量PCR仪进行基因定量分析。

表1 Hsp70和Hsp90的基因引物序列

1.4 槲皮素或槲皮素衍生物对Hsp mRNAs表达的影响

基于本研究中抗植物病毒活性数据，研究500 μmol/L槲皮素、7,4＇-Di-O-甲基槲皮素、3-O-甲基槲皮素或7-O-甲基槲皮素对Hsp70mRNA表达的影响。将本氏烟置于光照培养箱中于42℃热激1 h后，叶面喷施槲皮素和槲皮素衍生物，继续放置在42℃条件下热激1 h。收集本氏烟第3叶，采用RT-qPCR方法研究槲皮素或槲皮素衍生物对Hsp70mRNA表达的影响。

1.5 数据处理

采用SPSS version 11.5进行数据处理与分析。针对抗植物病毒活性和基因定量分析的数据，方差分析采用最小显著差异方法进行。

2 结果与分析

2.1 抗植物病毒活性

抗TMV活性测试表明，7,4'-Di-O-甲基槲皮素和3＇-O-甲基-6-氢-槲皮素对TMV的抑制活性较强，抑制率分别为68.46%、57.83%；槲皮素和3-O-甲基槲皮素也具有较高的抑制活性，抑制率分别为54.68%和52.47%。3,7,3＇,4＇-Tetra-O-甲基槲皮素和3,7,4＇-Tri-O-甲基槲皮素也具有一定的抑制活性，抑制率为49.38%和48.62%（表2）。

表2 槲皮素或槲皮素衍生物对4 种植物病毒的抑制活性

抗CMV活性测试表明，3-O-甲基槲皮素、3＇-O-甲基-6-氢-槲皮素、槲皮素、7,4'-Di-O-甲基槲皮素和3,7,4＇-Tri-O-甲基槲皮素具有较强的抑制活性，抑制率分别为54.82%、52.75%、52.41%、51.10%和50.35%。3,7,3＇,4＇-Tetra-O-甲基槲皮素也具有一定的抑制活性，抑制率为46.63%。其他的槲皮素衍生物对CMV的抑制活性较弱（表2）。

抗PVY活性测试表明，7,4＇-Di-O-甲基槲皮素对PVY的抑制活性最强，3＇-O-甲基-6-氢-槲皮素、槲皮素、3-O-甲基槲皮素、3,7,3＇,4＇-Tetra-O-甲基槲皮素和3,7,4＇-Tri-O-甲基槲皮素也具有较强的抑制活性（表2）。

抗RSV活性测试表明，7,4＇-Di-O-甲基槲皮素、3＇-O-甲基-6-氢-槲皮素、槲皮素、3-O-甲基槲皮素和3,7,3＇,4＇-Tetra-O-甲基槲皮素具有较强的抑制活性。而3,3-Di-OSO3H-槲皮素、6-羟基-槲皮素、7-O-甲基槲皮素、3,4＇-Di-O-甲基槲皮素对4种病毒的抑制活性较弱（表2）。

2.2 槲皮素对Hsp70和Hsp90 mRNAs的表达影响

RT-qPCR研究结果表明，高温热激处理的Hsp70mRNA表达倍数为3.59倍，采用不同剂量的槲皮素及高温热激处理能下调Hsp70mRNA的表达，其在125～1 000 μmol/L作用剂量下的表达倍数分别为2.03、1.84、1.61倍和1.44倍，随作用剂量的增加，表达倍数下调也越明显（图1）。此外，高温热激处理也可上调Hsp90mRNA表达，其表达倍数为2.87倍，125～1 000 μmol/L槲皮素及高温热激处理能下调Hsp90mRNA的表达，其表达倍数分别为1.08、1.02、0.94倍和0.83倍。综合Hsp70和Hsp90mRNA的定量PCR结果，发现槲皮素对Hsp90mRNA 调控效果显著于Hsp70mRNA（图2）。

图1 槲皮素对Hsp70 mRNA表达的影响

图2 槲皮素对Hsp90 mRNA表达的影响

2.3 槲皮素或槲皮素衍生物对Hsp70 mRNA的表达影响

RT-qPCR研究结果表明，热激处理的Hsp70mRNA表达倍数为3.59倍。槲皮素、7,4＇-Di-O-甲基槲皮素、3-O-甲基槲皮素、7-O-甲基槲皮素分别与42℃热激协同处理下的Hsp70mRNA表达倍数为1.84、1.21、2.26倍和2.77倍，下调比例分别为48.74%、66.30%、37.05%和22.84%。结果表明，7,4＇-Di-O-甲基槲皮素对Hsp70mRNA的调控最为明显（图3）。

图3 500 μmol/L槲皮素和槲皮素衍生物对Hsp70 mRNA的影响

3 讨论与结论

采用抗植物病毒病药剂防治植物病毒病是农业生产上一种主要措施。近年来，生产上主要采用的抗植物病毒病药剂主要是病毒治疗剂、病毒钝化剂和免疫激活剂，3类药剂各有优点和缺点。例如，病毒治疗剂存在用药次数多，推广成本高，对作物没有保护效果；免疫激活剂的施用最佳时期为病毒侵染前或作物苗期或发病早期。槲皮素是一种具有广泛生物活性的黄酮类物质，广泛存在于植物中。槲皮素也是中医药的主要成分之一，对人、畜和环境安全。基于槲皮素的母体结构进行新农药开发，在毒性、环境评价上潜在风险较小。为了探明槲皮素的活性基团，创制结构新颖、病毒抑制活性突出的槲皮素类似结构衍生物，本研究通过比较槲皮素及其衍生物的抗病毒活性，发现槲皮素及其衍生物7,4＇-Di-O-甲基槲皮素、3＇-O-甲基-6-氢-槲皮素、3-O-甲基槲皮素、3,7,3＇,4＇-Tetra-O-甲基槲皮素和3,7,4＇-Tri-O-甲基槲皮素对4种病毒具有较强的抑制活性，其结果与前人报道对PVX、番茄环斑病毒（TomRSV）、苹果茎沟病毒（ASGV）的抑制活性相似[10-11,25]。因此，我们推测槲皮素骨架分子上3位的甲基有助于提高抗植物病毒活性，7和4＇位甲基的存在可增加抗植物病毒的活性。关于槲皮素及其衍生物的作用机制的研究有少量报道。例如，3＇-O-甲基-6-氢-槲皮素作用于缺乏系统性获得性抗性的烟草，烟草缺乏相应的抗性物质，也不表现出抗病毒活性，提示槲皮素衍生物不会诱导增加植物寄主抗性[26]。同时，也有研究报道3,7,3＇,4＇-Tetra-O-甲基槲皮素在体外条件下对TMV粒子没有破坏作用[25]。此外，3,7,3＇,4＇-Tetra-O-甲基槲皮素或3,7,4＇-Tri-O-甲基槲皮素在体外条件下不影响TMV RNA复制，说明槲皮素衍生物对病毒没有直接的抑制作用[23]。目前，所有槲皮素及其衍生物抗植物病毒的活性均来自活体上的数据。因此，我们推测槲皮素及其衍生物对植物寄主产生了间接的影响。Hsp作为分子伴侣蛋白，可以帮助蛋白完成折叠、修饰等过程，使得蛋白表现出相应的活性。例如，Hsp70可与TBSV复制蛋白、Viral RNA复制子和rNTP等共同构成病毒复制酶复合体，促进TBSV的复制[25]。同时，前人研究也发现槲皮素可下调经TBSV侵染本氏烟的Hsp70，但关于槲皮素及其衍生物与Hsp70和Hsp90间的调控关系，至今未见有报道。本研究发现槲皮素可下调经高温热激的本氏烟的Hsp70和Hsp90。其中，对Hsp90的下调较Hsp70明显，量效关系发现500 μmol/L对Hsp的效果较为显著。此外，通过比较槲皮素及其衍生物对Hsp70的调控效果，我们发现7,4＇-Di-O-甲基槲皮素对Hsp的调控效果明显，这为今后筛选高活性的抗病毒物质提供启示。