海南罗勒精油成分及其抗氧化作用评价

周 欣 宋 宁 弓 宝 林 景▲

1.海南省第五人民医院制剂科，海南海口 570206；2.河南中医药大学药学院，河南郑州 450046；3.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所海南分所（海南省南药资源保护与开发重点实验室&国家中医药管理局沉香可持续利用重点研究室），海南海口 570311

罗勒为热带、亚热带草本植物，其来源于唇形科罗勒属植物罗勒（Ocimnm basilicum L.），又名九层塔、兰香、香草等，目前在我国华南、华东等多省区均有分布[1]。在我国传统医学中，罗勒常用于治疗胃肠不适、外感风寒、中暑、跌打损伤以及风湿性关节炎等症[2]；而东南亚国家如泰国、越南等在食品加工、餐饮等行业常将罗勒作为香辛调料使用。罗勒的茎、叶富含特殊气味的芳香精油，这既是罗勒的主要化学成分，也是其发挥功效的主要内在活性物质。种植企业对罗勒的栽培均旨在提高其精油成分含量方面，并通过精油单体分离生产出供药用或调香用的原料[3]。近年来罗勒在我国规模化栽培种植面积增加，栽培的品种主要为5个种和3个变种，而不同来源的罗勒品种其化学成分及生物活性相差较大[4]。海南地处亚热带和热带交接处，其独特的气候区域，使本地产的罗勒与其他省份所产的罗勒品种有所区别[5]，目前尚未有相关文献对海南罗勒的化学成分及生物活性进行报道。

本研究利用气质联用（GC-MS）技术对水蒸气蒸馏法提取的海南罗勒精油进行成分分析，并对其抗氧化活性进行评测，以期为海南罗勒的开发提供参考。

1 仪器与材料

样品于2021年6月采集于海南万宁兴隆南药园内的罗勒地上部分，经中国医学科学院药用植物研究所海南分所王德立研究员鉴定为唇形科罗勒属植物Ocimum basilicum L.，采收后放置通风阴凉干燥处待用；气相色谱质谱联用仪（GC-7890A，MS-5975C-MSD，美国安捷伦公司），HP-5MS色谱柱（5%Benzomethylsiloxane，30 m×0.25 mm×0.25μm）；挥发油提取装置；96孔板（Gracia Chemical Technology Co.Ltd）；酶标仪（美国Thermo公司）；分析天平（Mettler-Toledo Instruments，Ltd）；移液器（20 μl，200 μl，DRAGON-MED）；乙醚（Diethyl）、三吡啶基三嗪（TPTZ）、无水乙醇（Ethanol）、无水硫酸钠（Sodium Sulfate）、1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、氯化铁（Ferric Chloride）均为广州化学试剂厂生产。

2 方法

2.1 海南罗勒精油GC-MS分析

2.1.1 海南罗勒精油提取制备 参照贾小丽等[6]水蒸气蒸馏提取罗勒精油的方法进行样品的提取。将阴干后的海南罗勒全草粉碎成粗粉，称取100 g置入圆底烧瓶中，使用挥发油提取装置，采用水蒸气蒸馏法进行精油提取和收集，油水混合液使用乙醚萃取后用无水Na2SO4干燥，然后挥干乙醚，获得可流动的淡黄色精油0.2%（g/g）。

2.1.2 仪器分析条件 参考文献报道[7-8]，对气相色谱仪进行分析条件的设置，从50℃开始升温，以每分钟2℃速率升温至180℃，再以每分钟5℃升温至280℃；选用氦气作为载气；色谱柱的流量为每分钟1.0 ml，进样口温度为250℃；分流比为100∶1。EI源：电离电压为70 eV的，离子源温度为230℃，扫描范围：50～ 500 amu；进样量为 1.0 μl，按照上述分析条件进行分析鉴定，应用NIST谱库检索和质谱分析相结合的方法进行化学成分的确认，同时使用面积归一化法对各组分的相对含量进行计算。

2.2 海南罗勒精油的抗氧化作用评价

2.2.1 DPPH自由基清除率的测定 TPTZ工作液配制[9-10]：按照10∶1∶1的比例，将pH为3.6的醋酸钠缓冲溶液（3 μmol/L）、TPTZ（10 mmol/L）、氯化铁溶液（20 mmol/L）新鲜配制后，混合均匀。自由基清除率的测定：取100 μl DPPH的乙醇稀释液（6.5×10-5mol/L）置于96孔板中，同时加入10 μl精油，混匀后，设定在517 nm波长下进行测定，重复3次计算平均吸收值，并按照下列公式计算：

式中：A0为DPPH溶液100 μl+蒸馏水10 μl的吸光度；A1为 DPPH 液 100 μl+10 μl精油的吸光度；A2为10 μl精油+100 μl无水乙醇的吸光度。

2.2.2 评价海南罗勒精油抗氧化能力 在96孔板中加入10 μl海南罗勒精油，同时加入TPTZ工作液150 μl，混匀后，在538 nm波长处测定吸光度。以FeSO4为对照标准物质，以其浓度为横坐标，紫外吸收度为纵坐标绘制标准曲线，计算得出回归方程。将海南罗勒油的抗氧化能力以换算的FRAP值表示，以1 FRAP单位与1 μmol/L FeSO4的抗氧化能力相对等，即单位体积下海南罗勒精油的抗氧化能力相当于FeSO4的物质的量（μmol/L）。

3 结果

3.1 海南罗勒挥发油中的成分分析

结果共鉴定出化学成分27种，其中萜烯类成分占海南罗勒精油总量的78.24%。具体成分及相对含量见表1。

表1 海南罗勒精油中主要成分及相对含量

3.2 海南罗勒精油抗氧化能力评价

以FeSO4为对照标准物质，以其浓度为横坐标，紫外吸收度为纵坐标绘制标准曲线，通过计算得出回归方程如下：y=0.0022x+0.4545，相关系数R2=0.9987，见图 1。

图1 以FeSO4为标准物质绘制标准曲线

海南罗勒精油对DPPH自由基的清除能力及抗氧化能力测定见图2～3。从图2结果可以看出，海南罗勒精油对DPPH自由基的清除随着时间的推移而逐步增强，在50 min时对DPPH自由基的清除率可达到59.10%，说明海南罗勒精油可清除DPPH自由基且清除能力较好。从图3结果可以得出，海南罗勒精油抗氧化能力较好，且其抗氧化能力随着时间增加而增长，至60 min时可达到313.50 μmol/L。

图2 海南罗勒精油对DPPH自由基的清除能力（%）

图3 海南罗勒精油的抗氧化能力（μmol/L）

4 讨论

目前全世界罗勒属植物有150余种[4]，常规种有疏柔毛罗勒、丁香罗勒、柠檬罗勒等。近年来随着我国罗勒引种栽培面积的逐年增加，对罗勒挥发油的生物活性及临床应用研究逐渐受到了人们的关注。已有研究报道罗勒挥发油具有较好的抑菌、抗炎作用[4]，抗抑郁作用[11-12]，临床可用于治疗慢性腹泻[13]、不孕症[14]等，在我国维药等少数民族医学里，罗勒还被认为具有降血糖、抗血栓、降血脂等作用[15]。

据报道，不同栽培种及变种的罗勒，其挥发油成分类别及含量有一定差异，而植物精油的化学成分和含量又与其生物活性关系密切[4]，如亳州疏毛罗勒挥发油中萜类物质占60.61%，其对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌有很好的抑菌效果[16]；漳州产的甜罗勒以及云南产的甜罗勒挥发油中芳樟醇、丁香酚等含量均较高[8，17]，而甜罗勒对高血压患者疗效较好[18]；大型罗勒精油中香叶醛含量较高，能较好地清除自由基[19]；丁香罗勒挥发油中丁香酚含量较高，其在抗氧化性及抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌能力方面较强[11]。张帅等[20]对两广以及浙江等地的罗勒进行了成分检测，发现共有成分中成分含量差异可达10倍以上，在抗抗菌活性方面也有很大的区别。

本研究采用传统水蒸气蒸馏的方法对海南罗勒精油进行提取，并对其进行主要成分的分析和比对，共鉴定出27个化学成分，主要以萜烯类化学成分为主，相对含量较大的成分有反-3-苯基-2-丙烯酸甲酯（25.60%）、p-烯丙基茴香醚（23.43%）、β-芳樟醇（14.24%）等，这与文献报道的其他区域罗勒精油成分有很大差异[21]。反-3-苯基-2-丙烯酸甲酯作为高级香料添加剂，在食品、日用化妆品等领域被广泛使用，但其合成品存在合成效率低以及副反应多等问题[22-24]，因此是否能将海南罗勒作为其生产的原料来源值得深入探讨。如今，寻找更安全、更有效的天然抗氧化产品是很多产业尤其是食品工业关注的焦点[24]，实验表明，海南罗勒精油具有较好的抗氧化活性，短时间内清除自由基的能力可达到50%以上，因此海南罗勒具备作为新一代天然、安全抗氧化剂原料的开发潜力。

本研究仅对海南罗勒成分及清除自由基能力进行了初步的分析和观察，对海南罗勒的抗菌能力以及药效活性成分分析等工作尚未完成，后期课题组将针对其药效作用及物质基础进行更深层次的探索。