水稻α-淀粉酶基因的表达模式与颖花开放的关系

2023-04-10张绩周上铃何发刘莉莎张玉娟何晋宇杜晓秋

中国农业科学 2023年7期

张绩，周上铃，何发，刘莉莎，张玉娟，何晋宇，杜晓秋

水稻-淀粉酶基因的表达模式与颖花开放的关系

张绩，周上铃，何发，刘莉莎，张玉娟，何晋宇，杜晓秋

南充市农业科学院，四川南充 637000

【】淀粉降解与水稻浆片膨大和颖花开放过程密切相关，探究-淀粉酶基因在颖花开放过程中的作用，为杂交水稻制种效率及产量的提高提供理论依据。【】在水稻扬花时，利用稀释碱性品红溶液进行离体穗子吸水试验，观察碱性品红在颖花中残留的组织，通过碘-碘化钾染色法确定11—14期（依据雄蕊发育分期）淀粉粒的分布变化，并通过RT-PCR、RT-qPCR和报告基因检测多个-淀粉酶基因在此期间的时空表达模式。【】水稻颖花开放前，内外稃片通过相互嵌合的钩合槽（marginal tissues of palea，mtp）将浆片和雌雄蕊封闭在内。当颖花开放时，浆片快速膨大，使得内外稃片的钩合点松开。扬花期间，离体穗子在稀释碱性品红溶液中吸水后，碱性品红染料主要残留在内外稃片钩合槽和浆片相连处组织以及花丝中。碘染试验显示，在12期（颖花开放前），淀粉粒主要分布在雄蕊和内外稃片钩合槽，浆片中也有少量淀粉粒，在13—14期（颖花开放中），内外稃片钩合槽和浆片中的淀粉粒均降解。RT-PCR分析发现和的表达量从12期开始上升，至13—14期表达量显著增强，到受精后1 d（1 day after pollination，DAP1）表达量又明显下降，和在此过程中持续表达，表达量弱于RT-qPCR分析显示，在11—14期，表达量变化最显著，其次是和，的表达量变化幅度最不明显，和在13—14期表达量显著增加，而和在不同时期均表达，在13—14期表达量略有升高。在12期，主要在内外稃以及内外稃片钩合槽上表达，在13—14期主要在内外稃片钩合槽、浆片以及花丝上表达。【】水稻颖花开放过程中淀粉粒在mtp和浆片中明显降解，与、等-淀粉酶基因时空表达模式相对应，可能与水稻浆片膨大导致颖花开放过程密切相关。

水稻；-淀粉酶；颖花开放；淀粉粒；浆片膨大

0 引言

【研究意义】水稻颖花开放过程是一个反应迅速、精细调控的生理过程，对水稻授粉起重要作用。颖花开放闭合时间较短，一般不超过2 h，在这段时间内，颖花要完成花丝伸长、花药开裂、散粉、受精等一系列过程，开闭颖过程如果受到内、外部因素影响不能正常进行，会导致父、母本花期不遇，严重制约杂交水稻制种效率。研究水稻开闭颖分子调控机理，为杂交水稻制种效率及产量的提高提供理论依据，对杂交水稻稳产具有重要意义。【前人研究进展】水稻颖花开放是由浆片吸水膨大所启动，浆片膨大将外稃向外推开，同时将内稃向内压挤，使外稃和内稃的钩合点松开，外稃和内稃相互分开，同时雄蕊花丝急速伸长，使花药伸出颖壳并裂开，花粉散落，进行授粉。浆片中大量薄壁组织细胞中分散管状分子[1]，这种结构可能有利于浆片细胞内渗透压快速增加而吸水促使薄壁组织细胞迅速膨胀[2]。浆片的薄壁细胞无次生壁，只有初生壁，细胞中有大量液泡。浆片靠外稃一侧的薄壁细胞吸水后体积变化大，可增至开颖前体积的一倍[1]。Pissarek[3]测量玉米和滨草浆片的渗透压，发现其先升再降。YAN等[4]提取水稻膨大的浆片汁液，用菲林试剂测定呈现典型糖反应。Pissarek[3]推测水稻开花的渗压剂之一可能是淀粉快速水解的产物。王忠等[1]对开花前后水稻浆片的K+含量、可溶性糖以及淀粉等内含物作了比较，发现开颖前2 h、开颖中和开颖后2 h，浆片中K+含量（μg每对浆片）分别为2.208、2.240和0.788 μg；可溶性糖含量（μg每对浆片）分别为10. 32、23.25和12.55 μg；而淀粉含量（μg每对浆片）在开颖前2 h为10.05 μg，开颖中为6.52 μg。同时，还在浆片中检测到淀粉酶活性，并成功分离。结果表明，可溶性糖是引起水稻浆片渗透势变化的主要物质。淀粉是植物细胞中碳水化合物最普遍的储藏形式，在质体中合成，贮存在淀粉粒中。淀粉降解主要通过水解或磷酸化反应[5]，这个过程由多种酶共同作用，如-淀粉酶、-淀粉酶、淀粉脱支酶、-葡萄糖苷酶、淀粉磷酸化酶等[6]。-淀粉酶既可作用于淀粉粒，也可作用于可溶性淀粉，在淀粉降解过程中发挥重要作用[7-8]，-淀粉酶在胚乳中的水解作用研究较多，在种子萌发过程中，-淀粉酶从糊粉层和胚盾片分泌到胚乳中，降解淀粉粒中的淀粉[9-10]。在水稻基因组上有十余个-淀粉酶编码基因[11-13]，-淀粉酶时空表达模式研究发现不同异构体在不同组织中发挥其功能[14-15]。前人已分离到一些与开颖和浆片膨大相关的突变体，如，水稻生长素氧化双加氧酶（dioxygenase for auxin oxidation，DAO）失活的突变体，其不能正常开颖和散粉，表现单性结实[16-17]。通过分析突变体和野生型浆片中25个的RNA-seq数据，发现突变体中表达量显著降低[18]。OsARF2直接调节的表达。过量表达可显著恢复和突变体不能正常开颖和结实的表型[18]。突变体内外稃片最大张开角度显著大于野生型，其浆片吸水容量和膨大体积均大于野生型。研究发现调节浆片细胞壁纤维素[19]。2个等位突变体的小花均停留在开放阶段，OsJAR1是一个茉莉酸-氨基酸合酶，对小花开放、关闭以及花药裂开十分重要[20]。【本研究切入点】王忠等[1]在开颖期浆片中分离到淀粉酶，表明淀粉酶可能参与水稻颖花开放过程，促进可溶性糖含量增加，引起水稻浆片渗透势发生显著变化，但哪些淀粉酶在此过程中起作用，尚不明确。【拟解决的关键问题】本研究通过碘染检测水稻小花11—14期淀粉粒的分布情况变化，并通过RT-PCR、RT-qPCR和-淀粉酶启动子驱动报告基因分析水稻-淀粉酶在此过程时空表达模式，以期探究-淀粉酶基因在颖花开放过程中发挥其功能的作用部位。对-淀粉酶与颖花开放相关的时空表达模式研究有助于探明水稻开颖过程的调控机理

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料选用粳稻日本晴，栽植于南充市农业科学院试验田，按常规方法管理。在抽穗开花期，选择生长一致的稻穗用于试验。

1.2 碱性品红溶液吸水试验

上午8：00—9：00，选取当天即将扬花的穗子，在户外太阳照射下放置于稀释10倍的碱性品红溶液中，午后选取当天上午开颖扬花完毕的小花，于体视镜下观察品红在组织中的着色情况。

1.3 淀粉染色

将碘化钾和碘配制成1%碘试剂，置棕色瓶中暗处保存。选取水稻穗中部小花，用FAA溶液固定过夜，取出并加入适量0.1%碘化钾溶液。用玻璃棒搅动使小花全部浸没。静置1—2 h，于体视镜下观察。

1.4 表达载体的构建

用引物Os06g49970_PRO up和Os06g49970_PRO down扩增获得（Os06g49970）启动子（电子附表1）。pCAMBIA1301载体经dⅢ和Ⅰ双酶切，回收，以Klenow酶补平黏性末端，用T4连接酶连接平末端，改建为pGUS1301载体。用Ⅰ和Ⅰ双酶切pGUS1301载体和，将二者用T4连接酶连接，构建成::载体。

1.5 水稻转化与GUS染色

将构建好的表达载体转入农杆菌EHA105，利用农杆菌介导法转化水稻日本晴愈伤组织。用50 mg·L-1潮霉素B筛选阳性愈伤组织。筛选出的阳性愈伤组织在再生培养基上诱导出苗。提取再生苗DNA，用引物进行检测，将有目标条带的阳性植株移栽到温室土壤中进行生长。光照条件为16 h光照/8 h黑暗，温度保持在（27±5）℃。T0转基因植株收获种子，T1于正季种植于试验田中，并通过上述PCR方法检测出阳性单株用于GUS染色。

参照Jefferson等[21]方法进行GUS组织化学染色。取转基因水稻穗中部小花放入含X-Gluc的反应液，37℃染色16 h。用70%乙醇脱色，体视镜观察拍照。

1.6 RNA的提取及RT-PCR

使用TRIzol试剂分别提取11—14期穗中部小花总RNA，反转录成cDNA。PCR反应程序为94℃ 3 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，25—30个循环；72℃ 10 min。每个试验均重复3次以上。

1.7 RT-qPCR

RNA的提取和反转录成cDNA同1.6。PCR反应程序为95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃30 s，40个循环；72℃ 5 min。以水稻为内参基因。采用2-∆∆CT法计算得到基因的相对表达量。每个试验均重复3次以上。

2 结果

2.1 水稻开颖过程的观察

水稻花发育分期有多种定义，根据穗发育特征定义为8个阶段，根据雄蕊发育不同阶段定义为14个阶段[22]，为了检测-淀粉酶基因在开颖前和开颖中的表达模式变化，采用分期更为细致的14阶段。11期为小孢子进行第一次有丝分裂；12期为生殖细胞进行第二次减数分裂，13期为外稃张开，花药开始开裂；14期为授粉阶段。水稻颖花开放前，内外稃片通过相互嵌合的钩合槽将浆片和雌雄蕊封闭在内。浆片位于颖花基部，与内稃相连。水稻内外稃片开张是由浆片吸水膨大所致，浆片快速膨大，将外稃向外推开，同时将内稃向另一侧挤压，使得内外稃片的钩合点松开，同时雄蕊花丝也急速伸长，使花药伸出颖壳外进行授粉（图1）。

在扬花期，通过观察离体穗子吸收稀释碱性品红溶液浆片中快速膨胀和萎缩的组织，结果显示，在浆片和内外稃片钩合槽有较多品红染料残留（图2-A），花丝中也能观察到品红染料残留（图2-B）。

2.2 水稻花发育不同阶段淀粉粒的分布变化

观察11—14期小花淀粉粒的分布情况。11期，淀粉粒染色反应主要分布在小穗轴、内稃基部、内外稃片钩合槽及浆片中，雄蕊和雌蕊中均无明显染色。12期，淀粉粒染色反应主要分布于雄蕊、内外稃片钩合槽，浆片边缘也有微弱的着色；13—14期（开颖后1 h取材料）淀粉粒染色反应主要分布在花粉中，内外稃片钩合槽有微弱的着色（图3）。结果表明，淀粉粒在水稻小花11—14期的花粉中积累增加，而在小穗轴、内外稃片基部、内外稃片钩合槽以及浆片中逐渐减少。

A：左为13期，右为14期；标尺为2 mm；B：13期浆片放大观察，标尺为0.5 mm；C：14期浆片放大观察，标尺为0.5 mm

2.3 α-淀粉酶的RT-PCR分析

为进一步确定哪些淀粉酶基因可能在开颖过程中发挥作用。根据其序列结构特征，将水稻基因组的10个-淀粉酶分为3个亚家族——Amy1、Amy2和Amy3，前人对其中8个基因在种子发育及萌发过程开展了较为详尽的功能研究，分别为（Os02g52700）、（Os01g25510）、（Os06g49970）、（Os09g28400）、（Os08g36900）、（Os08g36910）、（Os04g33040）和（Os01g51754）[13, 23]；另外尚未开展功能研究的为（Os02g52710）和（Os09g28420）。这些-淀粉酶基因在水稻小花开颖前、中的表达模式尚未报道。

运用RT-PCR检测11—14期水稻小花中10个-淀粉酶基因的表达情况。结果表明，和在12期开始有微弱表达，13—14期表达量达到最高，受精后1 d（1 day after pollination，DAP1）又有不同程度下降。在此期间，均有较高水平的表达。持续表达，但表达量较弱。其他-淀粉酶编码基因的表达量很弱或基本无表达（图4）。

2.4 α-淀粉酶的RT-qPCR分析

进一步通过RT-qPCR检测11—14期水稻小花中4个-淀粉酶的表达量变化情况（图5）。、、和均在13—14期表达量最高，其中，在13—14期表达量比11—12期的增加幅度变化最大，和在13—14期表达量比11—12期增加幅度较小。

2.5 利用GUS报告基因分析OsRAmy2A表达模式

在开颖过程中表达量变化最为显著，通过PCR扩增克隆启动子构建表达载体转化水稻日本晴来检测其在颖花不同部位的表达模式。经PCR验证，获得7株阳性独立株系，对不同独立株系检测在11—14期的表达部位。11期在小花上无明显表达（图6-A—C），12期启动子驱动主要在内外稃上有表达，在内外稃片钩合槽处可见较明显GUS染色，其他花器官中无明显表达（图6-D—F）。13—14期在内外稃片中无明显表达，剥去外稃后，可见GUS染色主要分布在浆片、内外稃片钩合槽以及花丝等部位（图6-G—I）。

DAP1：受精后1 d。基因名旁括号内数字为RT-PCR循环数

图5 α-淀粉酶基因在小花开颖前、开颖中的RT-qPCR分析

A—C：11期；D—F：12期；G—I：13—14期，标尺为2 mm。An：花药 A-C: stage 11; D-F: stage 12; G-I: stage 13-14, Bar=2 mm. An: anther

3 讨论

3.1 α-淀粉酶基因在颖花开放过程中高水平表达，可能与颖花中淀粉粒降解密切相关

本研究10个水稻-淀粉酶在11—14期小花中有明显表达分化。和在11期基本不表达，12期开始弱表达，13—14期表达量最高，一直保持较高水平表达，持续表达但表达量较弱。其他6个-淀粉酶基因在11—14期颖花中表达量很弱或基本不表达。-淀粉酶基因在种子萌发过程中的表达模式及功能研究较为清楚，主要参与水解淀粉供胚生长。本研究和在颖花13—14期特异高水平表达，可能与颖花中淀粉粒降解密切相关。前人研究发现在开颖前2 h内，水稻浆片细胞内淀粉粒数量减少，淀粉粒减小，含淀粉粒细胞数量也迅速减少[24]。本研究关于颖花在开放前、开放中淀粉粒的分布变化结果与前人研究相似。突变体不能正常开颖，研究者对比分析了野生型和突变体上午9：00— 10：00收集的浆片的转录组，差异表达基因中包含多个淀粉、糖代谢过程相关基因[25]。本研究进一步为-淀粉酶基因参与浆片膨胀促使颖花开放这一过程提供了证据。除了通过RT-PCR、RT-qPCR方法检测-淀粉酶基因表达水平外，启动子驱动报告基因在颖花13—14期mtp、浆片中特异表达，与这些部位淀粉粒显著减少相对应，暗示等-淀粉酶基因参与调控颖花开放过程中淀粉粒降解。

浆片快速吸水膨胀促使水稻开颖发生[26-27]。王忠等[1]对开花前后水稻浆片的内含物做了比较，检测到开花时每对浆片的淀粉含量比开花前少3.53 μg，而可溶性糖增加了12.93 μg，证明开颖前水稻浆片淀粉快速降解转化为糖类物质，但因为膨大浆片中增加的可溶性糖含量明显大于减少的淀粉量，其可溶性糖除来自其自身淀粉水解外，还可能来自其他花器官的输入。浆片与内外稃片钩合槽相连，彼此之间无明显界限[2]。品红吸水试验显示开颖之后残留的品红主要位于浆片和内外稃片钩合槽相连处，说明此处的薄壁组织细胞经历了快速吸水膨胀和萎缩的过程，从而将外稃向外推开，使得外稃和内稃的钩合点松开。12期淀粉粒贮藏在内外稃片钩合槽中，13—14期碘染检测到该位置淀粉粒明显降解，说明其很可能是浆片可溶性糖的供应器官之一。颖花开放与花丝伸长几乎同时发生[28]。在13—14期花丝中的表达暗示淀粉降解可能也参与花丝伸长。

3.2 α-淀粉酶基因功能冗余在颖花开放中发挥作用

前人研究结果发现水稻所有-淀粉酶基因都在萌发种子、愈伤组织中大量表达，但在其他组织中表达模式明显分化。在受精后发育的子房和胚中表达，在受精后10 d胚中表达量最高[29]；在抽穗期叶鞘中表达量增加[30]。只在受精后42 d成熟种子胚乳中表达；在快要开花的成熟花药中表达量明显上调，在授粉后子房发育前期有较强表达[29]；呈组成型表达，即在不同萌发时间的种子、根、幼苗、不同发育阶段的花药、颖壳以及授粉后不同时期的子房中转录水平起伏幅度不太大[29]。-淀粉酶的表达分化说明不同基因受到特异调控，单个基因被敲除或突变后又无任何表型，说明多个-淀粉酶基因可能功能冗余在某一特定过程发挥作用，本研究和的表达模式比较类似，12期开始表达，13—14期表达量最高，DAP1表达量又下降。和的表达模式也比较类似，呈现持续性表达模式。这两种表达模式暗示它们可能受到不同上游因子调控[26-28]。

4 结论

水稻颖花开放淀粉粒降解主要发生在mtp和浆片中，和在颖花开放时表达量显著增加，在mtp、浆片和花丝中特异表达，可能与颖花开放时淀粉降解以及浆片膨大密切相关。

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Expression pattern of the rice-amylase genes related with the process of floret opening

Zhang Ji, Zhou Shangling, He Fa, Liu Lisha, Zhang Yujuan, He Jinyu, Du Xiaoqiu*

Nanchong Academy of Agricultural sciences, Nanchong 637000, Sichuan

【】Starch degradation is involved in lodicule absorbing abundant water and swelling during rice floret opening, but the amylase genes associated with this process have not been identified yet. 【】To identify the swelling of tissues during floret opening, therice panicles absorbed diluted Fuchsin basic and the dye remains were observed after florets were closing again. The starch grain distribution in rice florets before and during anthesis from stage 11 to stage 14 (according to 14 stages of rice anther development) was detected using iodide staining. The spatial-temporal expression patterns of 10-amylase genes were detected by RT-PCR, RT-qPCR and GUS staining. 【】Before floret opening, the stamens, pistils and lodicules are enclosed by the lemma and palea through marginal tissues of palea (mtp). Rapid swelling of the lodicules causes floret opening by separating the lemma from the palea. After thepanicles absorbed diluted Fuchsin basic during floret opening, the dye remains were observed located in the joint between mtp and lodicules and filaments. Iodide staining showed that the starch grains were mainly located in the stamens and mtp and a small amount of starch grains in the lodicules at stage 12 (before floret opening), whereas the starch grains in the mtp and lodicules were almost completely degraded at stage 13-14 (during floret opening). RT-PCR showed thatandbegan to express from stage 12 and were expressed with high levels at stage 13-14. The expression levels of the two genes decreased at DAP1 (1 day after pollination).andkept expressed during this process. The expression level ofwas higher than that ofThe RT-qPCR analysis showed that the expression level ofincreased most dramatically at stage 13-14, followed byand. Further, the transgenic plants expressing thereporter gene driven by thepromoter were generated. The GUS signaling was located only in the lemma, palea and mtp at stage 12 and the expression of thegene driven by thepromoter was induced in the mtp, lodicules and filaments at stage 13-14. 【】These data indicated that starch grain degradation in the mtp and lodicules at stage 13-14 might be related with high expression levels of some-amylase genes such asand, probably involved in controlling lodicules swelling and floret opening in rice.

rice;-amylase; floret opening; starch grain; lodicules swelling