双歧杆菌及其制剂对炎症性肠病作用机制研究进展

杨 硕，唐宗馨，段勃帆，陈禹含，郭欢新，孟祥晨*

（东北农业大学食品学院，乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030）

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一种慢性复发性炎症性疾病，包括克罗恩病（Crohn’s disease，CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）[1]。免疫失衡、肠道屏障通透性的改变、微生物群的状态以及饮食与生活方式等环境因素的变化都对该病的发生和发展有很大影响[2]。Jacob等[3]于2020年对IBD发病率进行统计分析发现，每年欧洲UC的患病率为24.3～505.0/10万 人，而CD的患病率为12.7～322.0/10万 人；北美UC的患病率为19.2～249/10万 人，而CD的患病率为20.2～319/10万 人。近年来随着城市化进程不断发展，中国IBD的发病率也逐渐上升，到2025年预计将有150多万IBD病例[4]。目前，IBD的治疗方法聚焦在应用抗炎药物方面，如糖皮质激素、5-氨基水杨酸、硫嘌呤生物制剂等可用于不同类型的IBD治疗[5]。随着对肠道菌群研究的深入，益生菌治疗也成为研究热点，双歧杆菌作为肠道内的优势有益菌群，菌体自身或其代谢产物可黏附于肠道，阻止致病菌的定植以及易位[6]。本实验室前期研究表明，将两歧双歧杆菌H3-R2作用于免疫低下小鼠中可修复肠道黏膜，调节炎症因子，同样证明双歧杆菌具有替代治疗或者辅助治疗IBD的潜力[7]。本文综述了双歧杆菌及其制剂在IBD治疗中的应用及其作用机制。

1 双歧杆菌及其制剂概述

肠道菌群具有转化食物、调节免疫功能、影响脂肪储存等重要功能[8-10]。双歧杆菌属作为肠道菌群的主要组成部分，其代谢过程中产生的共轭亚油酸（conjugated linoleic acid，CLA）、胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）、短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）以及吲哚-3-乳酸（indole-3-lactic acid，ILA）等多种物质均已被证明具有调节肠道稳态及其他多种生理功能[11-14]。同时，双歧杆菌也因其可增强免疫、抵制有害菌侵入等多种益生功能而在工业上被广泛生产制备为缓解肠道疾病制剂。常见的有双歧杆菌三联活菌片、双歧杆菌四联活菌片、常乐康以及金双歧等制剂[15]。

市售双歧杆菌制剂种类有限并且多为复合益生菌制剂，单菌制剂较少，除受双歧杆菌自身严格的生长条件影响外，还因有研究表明，治疗UC时应用混合益生菌的疗效优于使用单菌株疗效[16]。Wang Nana[17]、Fujiwara[18]、Philippe[19]等的实验均证明动物双歧杆菌、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌17具有缓解结肠炎效果。但Yu Rui等[20]将青春双歧杆菌IF1-03以及青春双歧杆菌IF1-11分别作用于葡聚糖硫酸钠盐（dextran sulfate sodium salt，DSS）诱导的IBD模型小鼠，发现IF1-03对DSS诱导的结肠炎具有保护作用，而IF1-11却几乎没有改善作用。同时，Fleming等[21]发现短双歧杆菌BBG-001对于恢复肠道屏障、调节肠炎无明显效果。以上结果表明，不同种乃至不同株的双歧杆菌益生效果具有菌株特异性，针对不同菌株的作用效果仍需继续进行探索。

2 双歧杆菌及其制剂在IBD中的应用

UC和CD的发病原因、病理特征和病变范围不完全相同，UC病变主要集中在结肠，以黏膜炎症为特征，而CD的病变范围涉及到整个胃肠道，以透壁炎症为特征[22]。研究发现将益生菌应用于UC治疗比应用于CD治疗更有效[15]。同样地，双歧杆菌及其制剂在IBD中的应用也更多集中于UC的治疗。

双歧杆菌及其制剂广泛应用于UC的治疗，Amiriani等[23]采用随机、双盲临床试验方法将60 名轻中度UC患者分为两组，随机给予包含双歧杆菌的复合益生菌制剂或安慰剂进行为期8 周的治疗，结果显示益生菌组临床结肠炎活动指数（simple clinical colitis activity index，SCCAI）显著降低，并且益生菌组的治疗效果在超过5 年病龄的患者中更加显著。另外，针对日本轻度至中度活动期UC患者的实验结果表明，长双歧杆菌536不仅在肠道中具有良好的耐受性，而且用其治疗8 周后显著降低了患者疾病活动指数（disease activity index，DAI）和结肠Rachmilewitz内镜指数（endoscopic index，EI）[24]。除此之外，双歧杆菌与治疗UC的药物联合还具有协同作用，di Pierro等[25]研究表明长双歧杆菌W11可作为抗生素治疗的辅助剂，比单独使用利福昔明治疗效果增加了一倍。Palumbo等[26]研究表明，与单独接受美沙拉嗪治疗相比，接受美沙拉嗪联合含有双歧杆菌的复合益生菌治疗的UC患者病情得到更好的改善；而且益生菌的联合治疗效果甚至在治疗两年之后也依旧明显。

由于CD发病机制相对复杂、并发症多，双歧杆菌及其制剂在治疗CD方面的研究相对有限[27]。Fedorak等[28]评估了益生菌合剂VSL#3（8 种不同的益生菌种类的混合物，包含3 株双歧杆菌）预防CD术后复发的效果，结果发现与术后90 d后再进行益生菌晚期干预治疗相比，在行肠切除术后立即接受并持续接受一年的VSL#3治疗可显著降低白细胞介素（interleukin，IL）-8、IL-1β等促炎细胞因子的水平，同时显著降低术后复发率。Steed等[29]应用长双歧杆菌和Synergy1组成的合生元对35 名活动性CD患者进行为期6 个月的治疗，发现合生元显著降低了黏膜组织中的肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α水平，并促进了双歧杆菌对肠道黏膜表面的定植。最终，接受合生元治疗患者的临床症状得到显著改善，DAI有所降低。然而，也有研究表明将动物双歧杆菌作用于从CD患者分离衍生出的巨噬细胞无明显有益作用[30]。由于益生菌应用于CD治疗的研究较少，双歧杆菌及其制剂在CD治疗中的应用仍需进一步验证。

3 双歧杆菌及其制剂对IBD作用机制

3.1 调节免疫系统

双歧杆菌及其制剂可以通过其菌体成分或代谢产物等作用于炎症信号通路（图1），调节炎症因子等物质的产生，从而调节免疫系统，起到抗炎作用。

图1 双歧杆菌及其制剂调节IBD的经典信号通路Fig.1 Classic signaling pathways for IBD regulation by Bifidobacterium and its preparations

首先，无论是菌体成分还是其代谢产物均需结合细胞膜受体发挥作用，经双歧杆菌代谢产生的乙酸等SCFAs结合GPCRs，从而刺激下游炎症信号通路发挥抗炎作用[31]。TLRs是主要的结合通路，TLRs作为模式识别受体可感知和识别病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），如未甲基化的双链DNA、单链RNA、肽聚糖、脂蛋白等，从而激活下游信号，需注意TLR2必须与TLR1或TLR6形成异二聚体才能传输信号[32]。信号传输下游炎症信号通路主要有3 条：1）NF-κB通路：重要下游炎症信号通路，经刺激后，IκB泛素化降解，使P50/P65二聚体进入细胞核诱导靶基因转录[33]；2）JAK-STAT通路：经膜受体识别，随着JAK的激活，使STAT磷酸化，而后形成磷酸化STAT二聚体入核，诱导靶基因转录调控炎症[34]；3）MAPK通路：MAPK家族主要有3 类——JNK、ERK和p38 MAPK，通过3 条级联反应方式进入细胞核内，形成AP-1、TCF、ATF2等转录因子，调控炎症因子表达[35]。大量研究表明，双歧杆菌及其制剂可以作用于以上通路的关键蛋白，进而调节IBD，表1列出了双歧杆菌作用以上炎症信号通路及作用效果的相关研究。

表1 双歧杆菌调节IBD的经典信号通路Table 1 Classical signaling pathways for IBD regulation by Bifidobacterium

3.2 调节氧化应激反应

近年来的研究表明氧化应激在IBD的致病机理中起关键作用，生理条件下氧代谢可产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），在机体健康情况下，一定含量的ROS对于维持正常的肠道稳态有益，但当肠道发生炎症时会产生ROS，肠道通透性会随着ROS积累量的增加而增高，可导致肠道细菌通过肠壁转位增加，加速炎症反应[48]。另外，IBD以广泛聚集中性粒细胞为特征，髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）作为中性粒细胞原代颗粒的标志，通过过氧化物酶循环等途径能有效地生成ROS[49]。研究表明服用含有双歧杆菌的复合益生菌可以显著降低MPO含量，降低肠道炎症小鼠的组织病理学评分[50]。

Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1）/核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）通路是组织和细胞中最重要的抗氧化防御系统之一，可调控抗氧化酶的基因和蛋白表达，正常状态下胞质中的Nrf2泛素化后被降解，而在受到刺激后胞质中的Nrf2从与Keap1结合的复合物中解离下来进入核内，与抗氧化反应元件（antioxidant responsive element，ARE）结合进行谷胱甘肽（glutathione，GSH）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等的转录[51]（图2），这些抗氧化蛋白表达量在IBD患者中均有所降低。Wang Yuanyuan等[52]用植物乳杆菌ZDY2013与两歧双歧杆菌WBIN03的单菌悬液及混合菌悬液灌胃经三硝基苯磺酸（trinitrobenzenesulfonic acid solution，TNBS）诱导的IBD小鼠，结果表明益生菌治疗组通过激活Nrf2通路，使血清中谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）、CAT和SOD活性提高，结肠组织中抗氧化酶相关因子SOD1、GPX2、CAT相对表达量增加，从而通过抗氧化途径使小鼠结肠炎症有所缓解。

图2 不同状态下的Keap1/Nrf2通路Fig.2 Keap1/Nrf2 pathway in different states

双歧杆菌的代谢产物也可通过调节氧化应激反应缓解IBD，长双歧杆菌CCFM752上清液可以增强A7R5细胞内CAT活性，降低还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶活性，从而表现出抗氧化的特性[53]。婴儿双歧杆菌代谢产生的吲哚乳酸（indole-3-lactic acid，ILA）可以与芳香烃受体（aryl hydrogen receptor，AhR）结合刺激Nrf2通路，增加靶基因GPX2、SOD2和NAD(P)H脱氢酶的mRNA表达，通过调控氧化应激反应保护肠道细胞[54]。齿双歧杆菌可以分泌γ-谷氨酰半胱氨酸，该半胱氨酸可转化为抗氧化剂并抑制氧化应激。含有γ-谷氨酰半胱氨酸的细菌分泌产物以及纯化的γ-谷氨酰半胱氨酸进入细胞并上调GSH水平，从而抑制内质网应激介导的ROS，并使内质网应激表型最小化，调节未折叠蛋白反应，从而使黏液蛋白的表达量增多，调节IBD反应[55]。

3.3 恢复肠黏膜屏障

肠道黏膜屏障是宿主抵御致病菌和感染的第一道防线，在IBD愈合以及恢复过程中维持肠道黏膜屏障完整性以及免疫稳态至关重要[56]。肠黏膜屏障由微生物屏障、机械屏障、化学屏障、免疫屏障4 个部分组成[57]，这4 个部分在肠道内共同作用（图3）。

图3 肠黏膜屏障Fig.3 Intestinal mucosal barrier

微生物屏障是指寄生在肠道的微生物与宿主形成的复杂肠道生态系统，自出生开始，宿主肠道微生物逐渐具备复杂的消化和代谢功能，形成多样的以及稳定的常驻菌群，该菌群通过彼此间共生、拮抗、与致病菌竞争结合位点以及直接或间接参与抗菌物质的合成，进而展现出抗炎和免疫调节的作用，对肠道内维持稳态环境至关重要[58]。研究表明，IBD患者肠道菌群稳态失衡，与健康受试者相比，双歧杆菌属、真杆菌属和柔嫩梭菌属等肠道有益菌属含量显著降低，而拟杆菌属等潜在致病菌属含量显著增加[59]。研究表明，改善肠道微生物组成已成为治疗IBD的重要辅助手段[49]。Yang Bo等[60]利用短双歧杆菌CCFM683灌胃DSS诱导的IBD模型鼠后对其粪便菌群进行分析，发现在科水平上双歧杆菌可以抑制DSS导致的紫单胞菌科和脱硫弧菌科相对丰度增加，同时增加消化链球菌科的丰度，进而恢复肠道菌群平衡。同样地，马岩等[61]给DSS诱导的IBD模型小鼠灌胃动物双歧杆菌乳亚种XLTG11后对结肠内容物进行分析。结果表明，在门水平上，双歧杆菌组抑制了DSS导致的变形菌门丰度升高，且增加了厚壁菌门和放线菌门的丰度。在属水平上，双歧杆菌组增加了双歧杆菌属、乳杆菌属、粪杆菌属等有益菌属的丰度，降低了幽门螺旋杆菌属等潜在治病菌属的丰度。

化学屏障包括肠腔内水分、消化液以及肠黏液层，其中起重要保护作用的为肠黏液层，它位于肠黏膜屏障的最外层，可以起到保护肠黏膜不受有害微生物破坏及酸碱侵蚀的作用，从而为上皮细胞提供一个完整的防御，以抵御有害物质和病原体，它是宿主与肠道内环境接触的第一道屏障[62]。Kiu等[63]将短双歧杆菌UCC2003灌胃小鼠2 周后，对小鼠肠上皮细胞的转录组进行分析发现，编码黏蛋白的编码基因Muc2、Muc6、Muc5b和Muc4表达量均显著上调，证明了双歧杆菌对化学屏障的保护作用。同时，Caballero-Franco等[64]研究发现，Wistar大鼠口服补充VSL#3对黏液结构有影响，并刺激Muc2基因的表达，但对Muc1和Muc3表达量的影响很小；另外，非黏液糖蛋白的分泌量也增加，这导致肠道黏液含量增加了60%，提高了肠道屏障的通透性，从而起到保护肠道的作用。

机械屏障主要由肠上皮细胞与相邻细胞间的连接构成完整的肠上皮结构，其连接方式包括紧密连接、缝隙连接、黏附连接及桥粒连接等，而围绕在上皮顶侧的紧密连接则是维持肠黏膜机械屏障的结构基础，是机械屏障最重要的结构[65]。短双歧杆菌UCC2003灌胃后的小鼠与空白对照组小鼠相比，其转录组中与机械屏障功能相关的关键基因表达量显著上调，其中包括编码闭锁小带蛋白1（zonula occludens 1，ZO-1）蛋白的Tjp1基因[63]。Chen Xiaohong等[66]给TNBS诱导的IBD模型鼠灌胃长双歧杆菌HB5502后发现，小鼠结肠中紧密连接蛋白ZO-1、闭合蛋白（Occludin）-1和密封蛋白（Claudin）-1的表达量显著升高。Ling Xiang等[67]的实验同样证明，双歧杆菌作用于脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的炎症细胞可上调Occludin、Claudin-3和ZO-1这些紧密连接蛋白的表达。

免疫屏障主要由肠相关淋巴组织（gut-associated lymphatic tissue，GALT）和分泌型免疫球蛋白（secretory immunoglobulin A，SIgA）以及相应的免疫反应构成，肠道免疫屏障是肠道免疫稳态的重要保障[68]。Shang Jiacui等[7]将两歧双歧杆菌H3-R2作用于免疫低下小鼠，实验结果表明此菌株可以促进强SIgA的产生，促进免疫抑制小鼠脾淋巴细胞增殖，具有免疫调节作用。同时，Treg在免疫反应中起关键作用，Zhou Linyan等[69]将婴儿双歧杆菌作用于DSS诱导的IBD小鼠后，小鼠结肠组织中叉头框蛋白P3（forkhead box P3，Foxp3）表达量升高，另外细胞因子IL-10和转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）表达量也升高，Foxp3表达量随菌液浓度的增高而呈现明显升高趋势，由于Foxp3是控制Treg发育和功能的关键转录因子之一，因此证明此婴儿双歧杆菌可通过促进Treg细胞的增殖参与肠道内的免疫调节而在IBD的治疗中发挥作用。

4 结 语

双歧杆菌作为肠道重要的有益微生物之一，已用于IBD的治疗，主要通过调节免疫反应、抗氧化应激以及保护肠黏膜屏障作用3 种不同机制发挥功效。通过以上综述发现，该方面研究存在以下特点：首先，在UC以及CD治疗中，因二者发病机制不一致，双歧杆菌的治疗效果也不相同；其次，目前双歧杆菌作用于肠道炎症的研究多为短疗程；最后，单株或混合菌株的治疗效果有显著差异，双歧杆菌的不同种甚至是亚种都有不同的作用机制。因此，继续深入探索双歧杆菌不同菌株在UC以及CD发生发展中的作用，需要注意其作为长期治疗手段的安全性，同时目前研究大多集中于菌体直接作用，深入挖掘起作用的菌体成分及代谢产物能否靶向抑制炎症信号通路的关键蛋白对今后的临床治疗意义重大。