益生菌在盐碱养殖水体中调控作用的研究进展

赵度宾 李月红 来琦芳 覃钦博

(1 吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118; 2 中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090; 3 湖南师范大学省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室，长沙 410081)

近年来，随着我国人口的增长以及淡水资源的减少，我国人均可利用水资源不足且远低于世界水平，在此形势下，有效开发和利用内陆、滨海地区蕴藏着的大量盐碱水资源已经成为盐碱水域地区解决淡水资源短缺、保证水产养殖健康可持续发展的一个重要途径[1-2]。益生菌能调节pH、均衡藻相、改良盐碱和抑制有害病菌，可用于全方位水质改良，在改良盐碱养殖水体中具有重要作用。目前，益生菌在水产养殖中已得到广泛应用，且已有较多相关报道，但其在盐碱水体中应用较少[3]。本文综述了能够改良盐碱水域水质的益生菌——光合细菌、乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌等在盐碱养殖水体调控作用方面的研究进展，旨在为盐碱养殖水体的水质改良提供参考资料。

1 盐碱养殖水体水质改良益生菌种类

在水质改良方面使用的益生菌主要有光合细菌、乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌等。

1.1 光合细菌

光合细菌(photosynthetic bacteria，PSB)是一类光合色素为菌绿素，能进行不产氧光合作用的原核生物，主要分为紫色硫细菌(PB)、紫色非硫细菌(PNSB)、绿色丝状菌(GFB)和绿色硫细菌(GSB)四大类。光合细菌富含生物活性物质和营养成分，如蛋白质、色素、辅酶Q 10(CoQ10)、5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)、聚羟基脂肪酸酯(PHA)，此外还含有80多种较高浓度的类胡萝卜素[4-5]。在养殖水体中，光合细菌能够提高溶解氧(DO)水平，去除氨氮、亚硝酸盐(NO2--N)，高效降解水中的污染物，具有较强的净水功能。刘福军等[6]发现，PSB可提高水体中溶解氧、硝态氮(NO3--N)的质量浓度，降低亚硝态氮、铵态氮(NH4+-N)的质量浓度，对浮游动物无明显影响。郑耀通等[7]研究发现，固定化光合细菌对模拟池水中化学耗氧量(COD)的去除率为60%，对氨氮的去除率高达90%，DO增加约38%。张明磊等[8]发现，在重碳酸盐水体中施用PSB后，NO2--N、NH4+-N质量浓度显著降低，pH和总碱度(Alk)无明显变化。

1.2 乳酸菌

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一类可利用碳水化合物进行发酵，产生大量乙酸、乳酸等有机酸的无芽孢革兰氏阳性菌。在代谢过程中，LAB利用有机碳的氮源发酵产生乙酸、乳酸等有机酸和亚硝酸盐还原酶，可有效降低水体的pH、亚硝酸盐含量和氨氮含量，增加溶解氧和透明度[9-11]。现已证明，施用适量的乳酸菌对调节水质、健康养殖有重要意义。夏岩石等[12]研究发现，人工接种乳酸菌Lact.1纯培养液能有效降解亚硝酸盐，乳酸菌培养液的pH随着培养时间的推移呈下降趋势。宋蓉等[13-14]的研究表明，在添加碳氮营养源的情况下施用干酪乳杆菌L821a，能在4 d内将水体中的亚硝酸盐质量浓度由8.0 mg/L降至3.35 mg/L，此外，投加乳酸可促进水体的反硝化作用。

1.3 芽孢杆菌

芽孢杆菌(bacillus)是一类产生芽孢、无荚膜、大多数有运动能力、革兰氏染色为阳性的需氧或兼性厌氧菌。在水产养殖中使用的主要有枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)和蜡样芽孢杆菌(B.cereus)等[15-16]。将适量芽孢杆菌添加到饲料中进行投喂，可促进养殖对象生长，增强其免疫力。沈斌乾等[17]研究发现，饲料中添加(2～5)×108cfu/g的枯草芽孢杆菌B115，能促进青鱼鱼种生长，降低饲料系数(从1.7降至1.5)。饲料中添加枯草芽孢杆菌E221，能缓解尼罗罗非鱼因高盐胁迫产生的负面效应[18]。芽孢杆菌又能用作水质调节剂，抑制有害菌群增长繁殖，改良水质，净化环境。罗毅志等[19]发现，当地衣芽孢杆菌分离株DSY002-2011在室外池塘的用量为1.35×105cfu/L时，池塘水体氨氮质量浓度较对照组降低了36%。

1.4 酵母菌

酵母菌(yeast)是一种结构简单、能发酵糖类的兼性厌氧型单细胞真菌。在水产上应用的主要有酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、假丝酵母(Candidaalbicans)等[20]。酵母菌菌体中蛋白质含量高，用作饲料时可部分替代鱼粉，同时富含多种必需氨基酸、维生素、矿物质和各种消化酶[21]。酵母菌可有效提高饲料原料的营养价值并降低其中的抗营养因子含量，如植酸、抗性淀粉等。经过加工的酵母培养物能增强水产动物的机体免疫力、抗氧化能力[22-23]。酵母菌发酵过程中所产生的有机酸可降低水体pH，可用于处理高浓度有机废水，还可同化硝酸盐，分解亚硝酸盐，吸附重金属离子。辛博等[24]研究发现，从浆水中分离出的酵母菌不但不产生亚硝酸盐，还可降解亚硝酸盐，在浆水发酵过程中接种酵母菌可使亚硝酸盐含量明显降低。此外，酵母菌可维持池塘生物群落多样性和稳定性。

2 益生菌对盐碱水体的改良作用

高pH、高盐、高碱、主要离子比例失调以及水质类型繁多等是盐碱水体的主要特点。与淡水不同，在盐碱水体中，钠、钾离子含量远高于钙、镁离子，缓冲性能较差。盐碱水体的水化学类型呈现多样化，我国内陆型盐碱水中，碳酸盐型较多，氯化物型和硫酸盐型较少，而滨海型盐碱水氯化物较多[25]。我国内陆盐碱水体的盐度在1.24～13.00 g/L，碱度在3.0～44.5 mmol/L，pH在8.20～9.45[26]。盐碱水体水质清瘦，物种多样性低，水化学指标复杂易变，造成渔业生产中水质不易调节和控制。在水产养殖中合理使用益生菌可有效改良盐碱水体。

2.1 pH调节作用

目前产酸的益生菌主要有乳酸菌类和芽孢杆菌(凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等)[27]。乳酸菌在无氧条件下可将葡萄糖转化成乳酸，降低pH，进而去除亚硝酸盐。乳酸菌降解亚硝酸盐的效率会受到氯化钠(NaCl)的抑制，可能是氯化钠影响了乳酸菌亚硝酸盐还原酶的生成，或抑制了乳酸菌亚硝酸盐还原酶的活性[28]。刘振民等[29]发现，在12%复原脱脂乳中，嗜温菌在28 ℃下发酵60 h后，测得pH为4.39～4.77，嗜热菌在37 ℃下发酵60 h后，测得pH为3.33～3.92。

酵母菌适宜的pH在3.0～7.5，其不耐受高pH，pH太高会导致其程序性死亡。Metacaspase Yca1是哺乳动物caspase蛋白酶垂直同源物，在酵母细胞凋亡中具有核心作用。在外源因素作用下，酵母菌会出现细胞膜完整但磷脂酰丝氨酸(PS)外翻、线粒体膜电位下降、细胞色素c(Cytc)释放、活性氧物质(ROS)释放、细胞核染色质收缩、DNA片段化等与高等生物细胞非常相似的凋亡特征。ROS也是酵母细胞凋亡中的核心调节分子。当受到外界刺激，胞内ROS产生过多而来不及清除时，机体会发生氧化应激反应，较高浓度的ROS可导致DNA、蛋白质和脂类等生物大分子功能被破坏，使细胞内线粒体膜结构受损，膜电位改变，最终引起细胞凋亡。因此，在盐碱水体中，酵母菌需要与其他种类的益生菌相互配合使用。

芽孢杆菌产生的芽孢耐盐碱可抵御外界不良环境，适合在盐碱池塘水产养殖中使用。某些芽孢杆菌酵解葡萄糖可产酸。张建新等[30]发现了一株耐高温的副地衣芽孢杆菌，该菌可以产生丙酸、丁酸和乙酸等多种短链脂肪酸。黑龙江八一农垦大学微生物研究室分离获得了一株具有产酸能力的短小芽孢杆菌BY-2037，在以蔗糖为碳源、酵母膏为氮源、乙醇体积浓度为3%的培养基中，在30 ℃条件下培养时，其产酸能力最强，发酵液pH为2.93[31]。周剑等[32]发现，在葡萄糖质量浓度为100～140 g/L时，凝结芽孢杆菌RS12-6的L-乳酸发酵产率比较稳定，可以达到90～135 g/L。

2.2 盐碱调节作用

具有盐碱调节作用的益生菌大多是从盐碱土、盐碱水体(底泥)、滨海洼地等分离筛选出的耐盐碱菌株，在非盐碱的普通土壤中耐盐碱细菌相对较少。嗜盐菌的细胞膜上存在视紫红质，能够利用光能转运H+形成质子驱动力，驱动ATP合酶合成ATP，通过Na+/K+转运蛋白在胞质内积累高水平K+来抵御所处的高渗环境[33-35]；嗜碱性细菌的细胞膜上存在Na+/H+逆转运蛋白，可将细胞内的阳离子转运到胞外以维持胞内pH。耐盐碱细菌还可快速摄取、积累大量氨基酸(谷氨酸、脯氨酸等)、四氢嘧啶、甘氨酸甜菜碱等相容性溶质，调节渗透压来适应外界高渗环境[36-37]。在渗透胁迫条件下，枯草芽孢杆菌通过proJ-proA-proH途径迅速合成游离脯氨酸以提高耐受能力[38-39]。

耐盐碱细菌中的部分菌株具有很好的降盐降碱调节作用。在代谢过程中，耐盐碱细菌分解葡萄糖等有机物，产生草酸、乙酸和乳酸等多种有机酸，可以中和盐碱水体中的CO32-、HCO3-，起到降碱作用。宋建等[40]从强碱性赤泥中分离出一株芽孢杆菌，经培养后可产生草酸、酒石酸、乙酸和乳酸，使培养基的pH从11降到6。燕红等[41]分离获得1株极端嗜盐碱菌株，其在pH为13、NaCl质量浓度为200 g/L的培养基中仍可生长，以蛋白胨作氮源时，培养基pH的下降率为12.9%，氯离子(Cl-)的降解率可达46.9%。芽孢杆菌呼吸作用产生的二氧化碳与水形成碳酸，进一步电离出H+、HCO3-、CO32-，H+与OH-生成水，CO32-则被微生物诱导矿化生成碳酸盐矿物。郭文文等[42]利用赖氨酸芽孢杆菌GW-2菌株在B4培养基上诱导形成了碳酸盐矿物。pH对离子结合有很大的影响，pH越高越有利于碳酸盐矿物沉淀。

嗜盐菌的蛋白质大多数都含有非极性残基和过量的酸性氨基酸，过量的酸性物质需要结合钠离子以屏蔽周围的负电荷，适应环境，依赖环境。在细菌细胞表面或其外部有各种有机大分子和其他低分子量的非聚合成分，组成胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)，EPS的主要成分是核酸、多糖和蛋白质，具有聚集细菌细胞，凝聚和吸附有机物、离子的功能[43]。EPS能够保护细菌、藻类细胞，减轻盐碱胁迫。Steele等[44]在培养基中添加黄明胶，使得藻细胞能够应对盐度胁迫。此外，EPS还参与介导CaCO3的沉淀，与大量游离的钙离子紧密结合，并使其以CaCO3晶体的形式沉淀[45-47]。孙雪等[48]从盐碱地筛选得到1株优势海水盐单胞菌菌株DB01(HalomonasaquamarineDB01)，胞外聚合物产能为0.21 g/g，降碱能力为8.7%。微生物还可通过改变EPS的产量和组成来改善其周围环境，以减轻盐胁迫的影响。

2.3 调节藻类

藻类作为水体环境的初级生产者，与益生菌有着密切关系，二者相互影响。菌藻共生的基础是营养物质交换，养殖水体中的有机物可被益生菌加速分解为无机物，从而加快物质循环，促进微藻生长。藻类利用光合作用合成有机物，为异养益生菌提供营养物质[49-50]。Kim等[51]在研究菌藻相互作用时发现，根瘤菌属(Rhizobiumsp)与小球藻(Chlorellavulgaris)共同培养，二者的生长速率分别提高了110%和11%。Amin等[52]发现，一种促生硫菌可通过分泌吲哚乙酸(IAA)来促进硅藻细胞分裂。一些菌对藻类有抑制作用，通过直接或间接的途径最终导致藻细胞溶解，或产生毒素和释放溶藻酶致藻细胞死亡，可用来防止蓝藻等有害藻类过度生长，阻止微藻的优势种群演替为蓝藻[53-54]。Lukwambe等[55]在南美白对虾养殖场中施用商业益生菌，在终末期阶段具竞争力的蓝藻(颤藻和鱼腥藻)的演替受到了显著限制。益生菌对绿藻门小球藻、硅藻门舟形藻的生长有积极影响，同时能改善水质，有利于对虾健康。

2.4 抑制有害病菌

益生菌对致病菌具有一定的抑制作用，可以替代抗生素应用于水产养殖。益生菌能分泌表面蛋白粘附定植在水产动物肠壁上，合成大量的有机酸和细菌素等物质，降低肠道pH，竞争性地利用肠道中的营养物质，从而成为优势菌群。酵母菌是兼性厌氧菌，能消耗肠道中的氧，抑制有害需氧菌的繁殖，起到调节肠道菌群的作用，还能为乳酸菌提供无氧环境和营养因子。窦晓明等[56]从酸奶中筛选出3株乳酸菌，其胞外产物(细菌素)能较好地抑制副溶血弧菌。杨勇[57]的试验表明，乳酸菌胞外产物的抑菌活性依赖于酸性环境，在酸性条件下，乳酸菌对鳗弧菌的抑制效率在90%以上。益生菌在生长代谢过程中能产生多种抗菌物质，如抗菌蛋白、脂肽类抗生素等。夏京津等[58]发现，解淀粉芽孢杆菌 (B.amyloliquefaciens)HE发酵液中的活性成分——脂肽类抗生素明脂肽可以改变菌体细胞膜的通透性，使胞浆内物质外漏，对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)均为137.97 μg/L。

3 结语

我国盐碱水域面积较广且仍在增多，发展以渔业利用为基础的盐碱水体养殖已成为开发盐碱水资源的重要方法之一[59]。但是，盐碱水质问题限制了盐碱水域水产养殖的发展。用益生菌改良盐碱养殖水质作为修复盐碱水体的一种生物方法，高效、成本低、无污染，是解决问题的重要途径之一。盐碱水体类型多样，益生菌的选择和使用还应根据水质理化指标给出针对性的方案。已有学者在耐盐碱益生菌的筛选方面取得重要进展，耐盐碱机制也有了系统的阐述。目前关于益生菌降盐碱的效果已有报道，如赵媛等[60]从青海湖耐盐碱微生物中筛选出1株降盐率为17.30%的芽孢杆菌RM3和1株降碱率为7.60%的嗜盐单胞菌RM25，但去除盐碱的作用机理尚未得到明确解释，有待于进一步深入研究。