三角帆蚌多糖对肉仔鸡生长性能、抗氧化及免疫功能的影响

2023-04-05夏伦斌马龙龙乔德亮何燕飞

浙江农业学报 2023年3期

夏伦斌，马龙龙，乔德亮，何燕飞，蒋平

(1.皖西学院生物与制药工程学院，安徽六安 237012； 2.安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室，安徽六安 237012)

近年来，随着人们生活水平快速提高，无毒、无害、无药物残留的绿色动物性食品越来越受到人们青睐，为此开发功能性饲料成为畜牧兽医研究者关注的重点。随着2020年我国农业农村部“禁抗、限抗、无抗”政策的出台，除中药类以外的所有促生长类药物饲料添加剂将全部退出养殖业，因此替代抗生素等药物的功能性饲料的研究将被赋予新的意义和成为重点关注领域。三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)，又称三角蚌、珍珠蚌、河蚌等，为我国特有种，在我国东部、南部地区的湖泊、沼泽及河流内有广泛分布[1]。早在《食疗本草》《本草纲目》就有记载，其既能食用又可药用[2]。研究表明，三角帆蚌富含多种生物活性成分，如多糖、多肽等[3]，具有特定的营养和药理功效，在抗肿瘤[4-5]、免疫调节[6]、抗氧化[7]、抗菌[8]和抗组织器官损伤[9-11]等方面发挥着重要的生物活性作用；此外，研究还发现河蚌多糖可以通过增加肠黏膜相关免疫细胞数量、提高肠道溶菌酶活性和促进肠道菌群平衡来增强罗非鱼肠道黏膜的免疫功能[12]。在前期的研究中，本试验组成员Qiao等[13]优化了三角帆蚌多糖(Hyriopsiscumingiipolysaccharides， HCP)的提取，并纯化了粗HCP，评估了HCP的免疫刺激活性，发现HCP具有一定的免疫增强活性[14]，并进一步在基因水平上揭示了HCP影响免疫活性的分子机制，证实HCP通过促进免疫低下小鼠脾脏中免疫受体[Toll样受体-4(TLR-4)、甘露糖受体(MR-1)]、细胞因子白介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA合成，以及提高脾脏和血清中TLR-4、MR-1、IL-6、TNF-α及核转录因子(NF-κB)的基因表达水平，增强免疫低下小鼠的免疫功能，且与HCP添加剂量呈现依赖相关性[15]。综上可见，三角帆蚌具有重要的营养和药用价值。有关HCP生物活性的研究主要以小鼠为研究对象，偶见有鱼，在畜禽生产上应用研究尚未见报道。本研究在试验组成员前期研究的基础上，以提取的HCP为原料，研究其对肉仔鸡生长性能、抗氧化及免疫功能的影响，为三角帆蚌开发为促生长、提高畜禽免疫力的功能性饲料添加剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验选用1日龄体重均匀、健壮的爱拔益加(AA)雌雄混合雏鸡苗240只，购自安徽海康肉鸡有限公司。

1.2 试验材料

三角帆蚌购自安徽省滁州市珍珠养殖场，HCP提取参照乔德亮等[2]报道的方法稍加改进，取三角帆蚌内脏组织，用组织匀浆机破碎，然后用胶体磨均质，得匀浆液。按每克匀浆液10 mL水添加，于80 ℃浸提4 h，浸提液离心10 min(4 000 r·min-1)，所得沉淀物用相同方法重复浸提1次，合并2次浸提液，用3倍体积的75%乙醇沉淀，4 000 r·min-1离心10 min得水溶性粗提物，接着运用Sevag法脱去粗提物中游离蛋白质，用90%乙醇再沉淀，离心获得HCP，提取的HCP相对于三角帆蚌内脏质量的提取率为3.57%，提取后经真空干燥低温保存备用。

1.3 试验设计

采用单因子随机试验设计，将240只雏鸡苗随机分成4组，分别设为正常对照组(HCP-0)、低剂量组(HCP-1)、中剂量组(HCP-2)、高剂量组(HCP-3)，每组设6个重复，每个重复10只鸡。试验期各组饲喂方案如下：HCP-0组饲喂基础饲粮，HCP-1、HCP-2和HCP-3组在饲喂基础饲粮的基础上分别添加200、400和800 mg·kg-1剂量的HCP(添加剂量参照文献[15]设定)，连续饲喂42 d。

1.4 基础饲粮及饲养管理

试验用肉鸡基础饲粮组成及营养水平见表1，营养需要量配制参照美国NRC (1994)建议的鸡的营养需要量。试验鸡采用三层阶梯式笼养，饲养于皖西学院小动物诊疗实验实训中心的实验动物房内，试验前进行全面清洁和消毒，试验期间每周带鸡消毒1次，给予自由饮水和采食，每日24 h光照，并按照AA肉鸡饲养管理规范手册操作和常规免疫程序进行疫苗接种。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.5 测定指标与方法

1.5.1 生长性能指标

试验前称量并计算每个重复组肉仔鸡初始平均体重；每周测定一次各重复组的饲料消耗量，42日龄禁食12 h后称量每个重复组肉仔鸡体重，计算每个试验组鸡的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.5.2 抗氧化指标

于试验第42日龄，从每个重复随机选取1只试验鸡，每试验组共6只，翅下静脉采集血样，4 ℃下静置30 min后离心(3 000 r·min-1)10 min，收集血清保存于-80 ℃冰箱备用。血清中总抗氧化能力(T-AOC) 、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及过氧化氢酶(CAT)的活性和丙二醛(MDA)含量采用试剂盒测定。所用试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.5.3 免疫器官指数

于试验第42日龄采集血样后屠宰，分别摘取鸡的脾脏、胸腺和法氏囊，并用吸水纸吸干其表面水分和去除表面脂肪后称重，与鸡的活体重相比计算以上各免疫器官指数。

1.5.4 血清免疫指标

于试验第21、42日龄采集血样，方法同1.5.2。血清中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白M(IgM)的含量采用间接酶联免疫吸附技术(ELISA)检测试剂盒测定，操作方法按试剂盒说明。所用试剂盒购自北京拜尔迪生物技术有限公司。

1.6 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 三角帆蚌多糖对肉仔鸡生长性能的影响

由表2可知，饲粮HCP添加水平对肉仔鸡ADG有明显影响，与HCP-0组相比较，HCP-2和 HCP-3组肉仔鸡ADG增加明显，差异极显著(P<0.01)，HCP-1组肉仔鸡ADG虽略有增加，但差异不显著(P>0.05)，HCP-2与HCP-3组间差异不显著(P>0.05)；肉仔鸡ADFI和F/G在试验各组间均无显著差异(P>0.05)。

表2 三角帆蚌多糖对肉仔鸡生长性能的影响

通过对ADG(Y)与HCP添加剂量(X)进行二次曲线拟合，建立回归方程：Y=-5.901X2+7.818X+55.315(R2=0.516)。依据回归方程可得，HCP添加剂量为662 mg·kg-1时肉仔鸡的ADG最大。

2.2 三角帆蚌多糖对肉仔鸡血清抗氧化性能的影响

由表3可知，饲粮HCP添加水平对肉仔鸡血清T-SOD、T-AOC、GSH-Px活性和MDA含量有明显影响。血清T-SOD活性，HCP-1、 HCP-2和HCP-3组均显著高于HCP-0组，差异极显著(P<0.01)；血清T-AOC、GSH-Px活性，HCP-2和HCP-3组均显著高于HCP-0、HCP-1组(P<0.05或P<0.01)，HCP-1组肉仔鸡血清T-AOC和GSH-Px活性相较于HCP-0组均有增加，但差异不显著(P>0.05)；血清MDA含量，HCP-2和HCP-3组较HCP-0组显著降低(P<0.05)，HCP-1组与其他各组之间均无显著差异(P>0.05)。饲粮HCP添加水平对肉仔鸡血清CAT活性的影响在各组之间均无显著差异(P>0.05)，但添加HCP各组的CAT活性均比HCP-0组有所增加，尤其HCP-2和HCP-3组CAT活性增加更为明显。

表3 三角帆蚌多糖对肉仔鸡血清抗氧化性能的影响

随着HCP添加剂量的增加，T-AOC、T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量均呈线性变化(P<0.05)和二次曲线变化(P<0.05)。通过对T-AOC、T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量(Y)与HCP添加剂量(X)进行二次曲线拟合，建立回归方程：Y(T-AOC)=-3.092X2+3.964X+16.671(R2=0.382)，Y(T-SOD)=-94.794X2+102.04X+115.47(R2= 0.676)，Y(GSH-Px)=-288.45X2+388.88X+1262.5(R2=0.430)，Y(MDA含量)=1.819X2-2.383X+9.775(R2=0.362)。依据回归方程可得，HCP添加剂量分别为641、538、674 mg·kg-1时肉仔鸡血清中T-AOC、T-SOD、GSH-Px活性最高，HCP添加剂量为633 mg·kg-1时肉仔鸡血清中MDA含量最低。以上结果表明，HCP添加剂量为538～674 mg·kg-1时，对肉仔鸡血清抗氧化指标有明显改善作用。

2.3 三角帆蚌多糖对肉仔鸡免疫功能的影响

2.3.1 三角帆蚌多糖对肉仔鸡免疫器官指数的影响

由表4可知，肉仔鸡饲粮添加不同水平HCP，仅见HCP-2组脾脏指数相较于HCP-0组显著增加(P<0.05)，而其余各组对肉仔鸡的免疫器官指数均无显著差异(P>0.05)。通过对脾脏指数(Y)与HCP添加剂量(X)进行二次曲线拟合，建立回归方程：Y=-0.628X2+0.671X+0.988(R2=0.179)，依据回归方程可得，HCP添加剂量为534 mg·kg-1时肉仔鸡脾脏指数最优。但此曲线拟合度偏低(R2<0.300)，可信度较低。

表4 三角帆蚌多糖对肉仔鸡免疫器官指数的影响

2.3.2 三角帆蚌多糖对肉仔鸡血清免疫指标的影响

由表5可知，在试验21 d时，HCP-1、HCP-2和HCP-3组肉仔鸡血清IgA含量较HCP-0组均显著升高(P<0.05)，而血清IgG含量仅有HCP-2组比HCP-0组显著增加(P<0.05)；在试验42 d时，虽然肉仔鸡血清IgA含量在各组间均无显著差异(P>0.05)，但HCP-2和HCP-3组肉仔鸡血清IgG含量均显著高于HCP-0、HCP-1组，且差异极显著(P<0.01)；对于血清IgM含量，在试验21 d和42 d时，对照组及3个试验组组间均无显著差异(P>0.05)。随着HCP添加剂量的增加，试验21 d时，肉仔鸡血清中IgG含量呈二次曲线变化(P<0.05)、IgA含量呈线性变化(P<0.05)和二次曲线变化(P<0.05)；试验42 d时，IgG含量呈线性变化(P<0.05)和二次曲线变化(P<0.05)。通过对IgG、IgA含量(Y)与HCP添加剂量(X)进行二次曲线拟合，建立回归方程：Y(21 d时IgG含量)=-2.316X2+2.383X+3.806(R2=0.391)，Y(42 d时IgG含量)=-3.561X2+4.952X+5.128(R2=0.594)，Y(21 d时IgA含量)=-0.684X2+0.732X+0.387(R2=0.405)。依据回归方程可得，HCP添加剂量为514 mg·kg-1时肉仔鸡血清中IgG含量在21 d达最高，当添加剂量为535 mg·kg-1时IgA含量在21 d达最高；添加剂量为695 mg·kg-1时肉仔鸡血清中IgG含量在42 d为最高。

3 讨论

3.1 三角帆蚌多糖对肉仔鸡生长性能的影响

多糖在植物、动物以及微生物体内含量丰富，研究发现，多糖不仅无毒副作用而且具有多种生物活性功能[16-17]。谢红兵等[18]研究表明，在断奶仔猪饲粮中单独或两两联合添加黄芪多糖、白术多糖和牛膝多糖可明显提高断奶仔猪ADG。冯士彬等[19]在湖羊羔羊饲粮中添加黄芪多糖，可以显著提高其生长性能、免疫力、抗氧化能力及养分物质表观消化率等生产性能。董金金等[20]研究报道了在哺乳犊牛饲粮中添加酵母多糖可促进犊牛营养物质消化吸收和生长发育，且每头犊牛的适宜添加量为2 g·d-1。如上所述，目前有关植物源多糖和微生物源多糖在畜禽生产性能上的研究报道较多，然而动物源多糖在畜禽生产应用上的研究国内外鲜有报道，仅见有来源于虾粕中的甲壳素[21]促进肉仔鸡生长和鸡内金多糖[22]提升尖吻鲈幼鱼消化、肠道抗氧化能力和改善其血清生化水平等指标进而促进生长的报道。本试验在肉仔鸡饲粮中添加不同水平的HCP，结果显示，中、高剂量HCP添加组肉仔鸡的ADG显著高于对照组，且差异极显著，说明从水生贝类动物三角帆蚌提取的多糖具有促进肉仔鸡生长的生物活性。

3.2 三角帆蚌多糖对肉仔鸡血清抗氧化性能的影响

在正常情况下，动物机体通过抗氧化系统不断清除机体代谢活动产生的具有强氧化作用的自由基，从而维持机体氧化还原系统的动态稳衡状态。国内外诸多研究表明，多糖具有良好的抗氧化作用。Long等[23]研究指出，肉鸡饲粮添加枸杞多糖可显著增加血清SOD和GSH-Px活性，且血清MDA含量呈线性下降。Qiao等[24]研究了HCP在体内外的抗氧化活性，体外实验表明，HCP能够清除超氧阴离子自由基、过氧化氢和DPPH自由基，体内实验发现，给d-半乳糖诱导的衰老模型小鼠口服15 d不同剂量的粗HCP后，血清中T-SOD、GSH-Px、CAT和T-AOC活性明显提高且具有剂量依赖性，而肝脏和血清中MDA的形成受到抑制，其含量显著降低。本研究结果显示，饲粮中添加中、高剂量HCP显著提高了肉仔鸡血清中T-AOC、T-SOD和GSH-Px活性，且显著降低了MDA含量；而低剂量组仅有T-SOD活性较对照组有显著提高。这与上面关于多糖抗氧化活性的研究报道相似，证实添加HCP具有增强肉仔鸡的抗氧化活性作用，且在添加一定剂量时其效果更好。

3.3 三角帆蚌多糖对肉仔鸡免疫功能的影响

免疫器官是机体执行免疫功能的组织结构，是淋巴活性细胞和其他免疫细胞发生、分化成熟、定居和增殖以及产生免疫应答的场所[25]。对于健康动物而言，免疫器官指数增加可反映免疫功能的增强。研究表明，多糖具有促进免疫器官生长发育的作用。李文娟等[26]对环磷酰胺免疫抑制小鼠灌胃给予不同剂量黑灵芝多糖后，发现黑灵芝多糖可改善环磷酰胺引起的小鼠脾脏指数下降，增强小鼠免疫功能。张代等[27]研究了大蒜多糖对肉鸡免疫功能的影响，结果发现大蒜多糖添加组肉鸡的胸腺指数、法氏囊指数较对照组显著提高。刘亚娟等[28]报道了随着枸杞多糖添加水平增加獭兔的脾脏指数呈上升趋势、胸腺指数以添加0.2%时最高。本试验结果中，中等剂量HCP添加组肉仔鸡的脾脏指数相较于空白对照组显著提高，低剂量组和高剂量组脾脏指数也有增加趋势，表明HCP具有促进肉仔鸡脾脏生长发育的作用。此外，研究证实HCP能够增强机体的免疫应答能力。陈文星等[29]研究发现，珠蚌多糖对免疫正常或免疫低下小鼠脾脏淋巴细胞都有促进转化和增殖的作用，从而增强小鼠免疫功能。Qiao等[30]研究指出，粗HCP及其纯化组分均能够显著促进脾脏细胞增殖，提高腹腔巨噬细胞酸性磷酸酶活性，增强腹腔巨噬细胞的趋化、增殖和吞噬能力。本研究表明，在试验21 d时，低、中、高剂量HCP添加组肉仔鸡血清中IgA含量均显著增加，中等剂量组还显著提高了肉仔鸡血清中IgG含量；在试验42 d时，中、高剂量HCP添加组肉仔鸡血清中IgG含量均比对照组和低剂量组显著增加，这进一步证实HCP能够促进肉仔鸡淋巴细胞增殖与分化，提高血清中免疫球蛋白的含量，改善肉仔鸡机体的体液免疫。由此可见，HCP具有促进肉仔鸡免疫功能的活性，其内在的免疫调控分子机制尚需进一步探究。