小胶质细胞在年龄相关性黄斑变性中的作用研究进展△

孟 欢 邓婷婷 罗 丹 金 明

年龄相关性黄斑变性(AMD)作为一种发生于黄斑部的眼底退行性病变，是造成全世界中老年人不可逆失明的主要原因。1990年至2019年间，我国AMD患病率显著上升，由于疾病导致的视力障碍、抑郁等所造成的健康生命年的消失也与日俱增，预计2050年我国仅新增患病人数将达4500万，成为一个严重的公共卫生问题[1-2]。AMD患者视力丧失的主要原因为黄斑部视网膜色素上皮(RPE)细胞死亡与光感受器细胞的丢失，根据眼底特征性改变，AMD在临床上可进一步分为萎缩型(干性)AMD与渗出型(湿性)AMD两种类型，前者以玻璃膜疣、地图样萎缩(GA)为典型表现，后者则以脉络膜新生血管(CNV)为主要特征，干性AMD患病人数庞大，约占AMD患者的80%以上，但湿性AMD患者病情更为急剧，是造成90%的AMD患者失明的主要原因[3-4]。

小胶质细胞(MG)是中枢神经系统(CNS)重要的免疫效应细胞，主要分布于大脑与脊髓，占体内神经胶质细胞总数的10%～15%[5]，于1919年被首次定义，MG与帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化症等多种CNS退行性病变的关联得到揭示，并成为治疗多种精神神经疾病的新靶点[6-9]。视网膜作为CNS的延续，MG在视网膜的不同生命阶段发挥重要生理功能，通过分泌促炎性神经毒性细胞因子和吞噬活性神经元等多种途径，参与了AMD、青光眼、视网膜色素变性等多种眼底病的神经退行性变[10]。本文将对近年来关于MG在AMD发生发展中的作用及分子机制的相关报道进行综述，以期探索AMD治疗的新方向。

1 关于MG的概述

1.1 MG的来源与发育MG属于单核吞噬细胞系统，是神经实质中唯一的髓细胞，起源于卵黄囊的红髓祖细胞，MG的前体细胞具有非常强的细胞增殖、免疫反应和神经分化潜能，在血-脑屏障形成之前，即小鼠胚胎约第8.5天(E8.5)、人类胚胎约第12～13周(GW12-13)时迁移到脑实质,在大脑中迁移、定居、分化、成熟，成为大脑中的免疫细胞，并显示出一定的跨区域形态异质性，最终达到维持中枢神经系统环境免疫平衡的稳定状态，拥有数月至数年的长寿命[11-12]。MG的发育和维持依赖于集落刺激因子1受体(CSF-1R)等传递的信号，CSF-1R抑制剂PLX3397连续7 d给药可消除成年小鼠90%以上的MG[13]，CSF-1和白细胞介素 34(IL-34)均是CSF-1R的配体，二者来源于不同的细胞，在脑内分布广泛但并不重叠，通过互补的表达与CSF-1R共同实现对MG数目及分布的调控[14]。正常状态下，MG是长期存活的，并通过缓慢的局部增殖维持数量与密度的稳定，不需要外源性的补充，但在疾病条件下，MG可快速克隆性增殖并迅速对损伤做出反应，发挥生理功能[15]。MG在物种进化上相对保守，其基本转录图谱在不同哺乳动物中高度相似，并且分布密度相当，这表明，MG在整个哺乳动物进化过程中发挥着总体相似的功能[16-17]。

1.2 MG的生理功能MG是具有吞噬功能的神经胶质细胞，是大脑扰动和神经退化过程中抵御病原体的第一道防线，对维持脑内稳态至关重要。生理条件下MG呈现静息状态，形态为胞体较小、突触细长的分支状，具有宿主监测、组织修复、维持神经元功能等作用，对其他神经胶质细胞稳态的维持也有一定作用[18]。MG通过分泌神经营养因子，参与并促进神经环路的成熟及吞噬凋亡的神经元来维持神经元的生理功能[19]，还对神经元的过度激活有抑制作用。Badimon等[20]通过促进CSF-1R消亡制作小鼠MG耗竭模型发现，模型小鼠对神经刺激产生了明显的高反应性，腹腔注射低于阈值的红藻氨酸可导致超过90%的小鼠癫痫发作(对照组仅为11%)。

在CNS受到炎症损伤等刺激时，MG被迅速激活，表现出胞体增大、胞浆空泡化、突起缩短的“阿米巴样”改变等活化状态，并迅速迁移至损伤部位并发生细胞增殖。活化后的MG有两种形态，包括M1型与M2型，受损部位的MG以不同的激活状态存在，并保持在炎症反应期间改变其功能表型的能力[21]。M1型活化也称为MG的经典活化，是固有免疫的第一道防线，通常发生于损伤产生最初的几个小时或几天内，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-12、一氧化氮合成酶(iNOS)等具有促炎效应的细胞因子被大量分泌，表现为明显的细胞毒性作用，或许与NLRP3等炎症小体的激活促进活性Caspase-1产生的机制有关；M2型活化也被称为MG的替代活化，有M2a、M2b、M2c 3个亚型，分别具有不同的表面标志物及生物功能，释放的IL-4、IL-10、IL-13和转化生长因子-β(TGF-β)以及精氨酸酶-1(Arg1)、几丁质酶3样蛋白3(YM1/Chi3l3)等在抑制炎症、组织重塑、血管生成、神经保护等方面有积极作用[22]。正常状态下，M1/M2型极化水平维持动态的平衡，而在病理状态下，这种平衡将被打破造成组织损伤。但也有研究表明，在受到损伤后，脑内MG并非简单地极化到M1型或M2型，而是由于周围复杂的信号级联而显示出混合型[23]。Kim等[24]通过对MG的高通量转录组测序(RNA-SEQ)研究也证实混合表型在单细胞水平上的存在，提示MG的极化或许存在更复杂的激活，而其调控机制需要进一步研究。

2 MG在AMD中的作用

2.1 健康眼底的MG视网膜内含有3种类型的胶质细胞，即MG、星形胶质细胞和Müller细胞，在防御病原微生物、启动炎症过程和组织修复中共同发挥作用。视网膜MG(RMG)与MG一样来源于胚胎时期的卵黄囊，是存在于视网膜内的主要吞噬细胞，数量占视网膜细胞的0.3%～1.0%，主要存在于内、外丛状层中，执行免疫监视、突触提炼、神经营养支持和清除碎片等多种功能，对维持视网膜突触结构和正常视觉功能有重要作用[25-26]。因损伤而消耗的RMG有两个外源性补充，包括约85%来自视神经中残留MG由视盘向视网膜的迁移和约15%来自睫状体/虹膜中的巨噬细胞自周边视网膜向后极部的填充，重新募集的吞噬细胞在视网膜内环境的影响下，可继续发挥RMG的功能[27-28]。RMG通过清除代谢产物、病原体、渗出的血清蛋白和细胞碎片，以及产生神经营养因子和抗炎细胞因子等功能维持视网膜稳态，但长期暴露于RMG激活状态所分泌的活性氧、促炎细胞因子等物质下的视网膜具有较高的神经变性风险[29]。

2.2 AMD病理状态下的MG衰老是AMD最重要的危险因素，有研究发现，衰老状态下，RMG表现出明显的CXCL13、CXCL14等具有促进细胞增殖和趋化功能的因子水平上调，导致RMG密度随着年龄的增长而增加，对神经退行性疾病的易感性增加[30]。由于RMG是卵黄囊来源的长寿细胞，再生能力有限，因此，衰老对RMG本身也可造成功能性的改变，老化的RMG表现出持续的炎症反应和吞噬缺陷，对炎症刺激的反应增强且持续时间长，对β-淀粉样蛋白(Aβ)的吞噬能力减弱[31]，成为AMD发生的重要危险因素；同时，在人类及小鼠中均观察到随着年龄增长，激活状态的RMG比例逐渐增大，激活的RMG表达更具促炎效应的CD68，导致IL-1β、TNF-α、血管内皮生长因子(VEGF)等分泌增加，进一步造成细胞结构紊乱和CNV的发生[32-33]。一项对AMD患者与健康人群的血清分析表明，巨噬细胞凋亡抑制因子(AIM)可能参与了AMD的发病过程，AMD患者血清内的AIM抗原与自身抗体水平较对照组高近2倍，并且当抗AIM ELISA反应性≥0.4时，患AMD的概率增加了18倍，免疫组化结果则显示，AIM在视网膜中主要表达于RMG[34]。

近年来研究发现，干性AMD患者眼底表现为drusen、视网膜变性与GA的发生，均与RMG的激活相关，drusen是位于RPE上或RPE与玻璃膜间的局灶性黄白色细胞外碎片沉积物，是干性AMD患者的典型病理改变[35]，RMG在视网膜下间隙(SRS)的积聚则是drusen的特征性表现，反映了单核细胞向视网膜迁移的增加，或免疫细胞从视网膜清除的失败，RMG吞噬能力的变化直接导致了drusen在球后部的沉积[36]。Aβ是drusen的主要成分之一，研究发现，在小鼠视网膜下注射Aβ-42可通过激活p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路诱导RMG活化和炎症细胞因子的分泌，导致光感受器细胞凋亡[37]。髓样细胞触发受体2(TREM-2)是清除Aβ-42的关键成分，Bhattacharjee等[38]研究发现，AMD患者RMG中存在明显的TREM-2缺陷，使其吞噬能力降低，这可能与miRNA-34a表达上调及NF-κB信号通路的激活有关。O’Koren等[39]分别对急性光损伤及RhoP23H/wt基因敲除造成的急性视网膜变性和慢性视网膜变性小鼠模型进行观察，结果发现，RMG在SRS迅速募集并附着于RPE顶端，而当使用白喉毒素特征性消耗RMG后，RPE黏附的吞噬细胞数量显著减少，这提示，在小鼠视网膜变性模型中SRS是以RMG为主的免疫环境，也是RMG发挥免疫效应的主要场所。

湿性AMD也称为新生血管性AMD，其典型表现为脉络膜血管侵入视网膜下形成CNV，导致眼底黄斑区反复的水肿、出血、渗出，RMG在此过程中有重要作用。Wieghofer等[40]使用激光制造实验性CNV模型，结果显示，在激光损伤部位出现了明显的RMG聚集，聚集的RMG表现为细胞体增大、分支减少等活化形态，同时，在周边可观察到单核细胞来源的巨噬细胞的募集。嘌呤代谢异常也被认为是造成眼底病理性血管产生的潜在因素，激光诱导CNV产生后，活化的MG表面嘌呤能受体2(P2)mRNA表达水平显著升高，而眼内注射其抑制剂PPADS则能显著影响MG的功能，同时抑制CNV的渗漏[41]。Losenkova等[42]研究发现，RMG表达P2Y12R、P2Y13R等关键性嘌呤受体，通过对自身极端分支和特异性突起的伸缩，与神经元胞体、血管形成局部的“嘌呤能连接”，进而协调控制局部三磷酸腺苷(ATP)和腺苷的水平，在调节眼内病理性血管生成中发挥关键作用。

2.3 MG极化对AMD的影响RMG的激活几乎贯穿AMD的病理全程，近年来研究发现，RMG的不同极化状态可能对AMD具有差异性影响。RMG的M1型极化所分泌的TNF-α、IL-1β、IL-18等促炎因子是AMD的重要危险因素，也是早期在Aβ等病理因素刺激下drusen形成的主要原因[43]。视网膜变性小鼠模型中，在视杆细胞快速退行性变的第14～28天内，活化的RMG细胞数量明显增多，且以M1型为主，TNF-α、IL-6、CD86、CCL2等因子均显著上调[44]。

RMG的M1型极化被认为是推动CNV形成的关键信号。RMG的M1型/M2型极化状态在氧诱导视网膜病变(OIR)的CNV模型中呈明显的时相性改变，小鼠M1型RMG的激活始于回到常氧环境的P12，并在P17达到高峰，此间NF-κb-STAT3信号通路被激活，TNF-α、IL-6、IL-1β表达增强，从P17开始M2型极化逐渐占据优势，IL-4-STAT6-PPAR-γ信号活性开始上调，促炎因子的释放被抑制，在P20时达到顶峰，与新生血管生长及自发消退的时相完全一致[45]。RMG对定位于视网膜外层的胆固醇氧化产物7-酮基胆固醇(7KCH)有明显趋化作用，亚致死浓度的7KCH通过激活NLRP3导致MG迅速极化为促炎的M1状态，血管生成因子表达量增加，直接促进了CNV形成[46]。Cao等[47]通过对AMD患者与健康人群尸检眼检测发现，AMD患者M1型巨噬细胞水平明显高于对照组，M1型/M2型的比值也显著升高。

2.4 MG在AMD治疗中的作用RMG参与AMD的病理机制被揭示后，有研究认为，RMG适度活化具有的视网膜的神经保护作用对早期AMD是有益的，但RMG持续激活释放的炎症因子将进一步加重疾病的损伤，RMG的激活既是疾病造成的结果，也是病情进展的推动因素。兴奋性毒素诱导的视网膜损伤伴随着神经细胞大量死亡及RMG的聚集和明显活化，而提前使用PLX5622(CSF-1R抑制剂)消融RMG后的视网膜损伤造成了更多的细胞死亡并且神经元存活减少，这提示，反应性RMG对视网膜神经元的保护作用[48]；TGF-β在体外有促进MG增殖的作用，被认为是RMG发育和维持的重要细胞因子之一[49]，Wang等[50]在体内观察到腺病毒载体(AAV)介导的TGF-β1疗法对视网膜变性模型的视锥细胞有明显保护作用，但在RMG耗竭小鼠上未观察到相关作用，这提示，RMG可能是TGF-β对视网膜变性发挥疗效的关键途径。阿魏酸是中药当归、川芎等的有效成分，对眼底退行性病变、缺血性病变等有良好疗效。Sun等[51]研究发现，RD10视网膜变性模型小鼠的RMG在P25呈明显的激活状态，阿魏酸的应用显著改善了这种表现，并抑制了TNF-α、IL-1β、CCL2等促炎因子的表达，还通过抑制STAT1的激活和干扰素调节因子8(IRF-8)的表达改善视网膜变性小鼠的眼底退行性病变程度。Roche等[52]在RD10视网膜变性的小鼠中发现了甲炔诺酮通过调节RMG对光感受器有神经保护作用，进一步研究发现，甲炔诺酮的应用使CX3CL1-CX3CR1的信号在RNA水平上调了1000倍，与其对视网膜外核层的保护作用相一致，而经CX3CL1处理后，显著抑制了RMG促炎性细胞因子的释放，这提示，CX3CL1-CX3CR1信号通路或许是调节RMG激活水平与方向并抑制视网膜损伤的关键。

近年来，RMG在湿性AMD治疗过程中也具有潜在功能，抑制RMG的激活或调节其极化方向对CNV的治疗有积极作用。RMG的M1型极化通常伴随IL-1β、TNF-α等促炎因子的大量释放，是眼底病理性血管新生的危险因素。抗VEGF药物是湿性AMD的一线治疗用药，对挽救患者视力、保护视网膜解剖结构有明显疗效。有研究表明，阿柏西普在小鼠OIR模型中可通过增加RMG分支数量、减少其在内丛状层及外核层的聚集等来调节缺氧过程中的炎症反应[53]。Jiang等[54]也观察到小窝蛋白-1(Cav-1)的通透性多肽Cavtratin通过减少MG和巨噬细胞的存活和迁移来抑制CNV。绿茶所含的多酚类物质表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)被报道具有抗氧化、抗血管生成等特性，Xu等[55]研究证实，EGCG前体药物在小鼠CNV模型中也可通过下调HIF-1α/VEGFR2通路及RMG的M1型极化水平发挥效应。与前述报道不同，有研究发现，RMG的M2型极化所表现的抗炎、促进再生作用在一定程度上也促进了CNV的形成。Xu等[56]研究发现，褪黑素在激光诱导的CNV模型中具有抑制血管增生的能力，可能是通过激活RhoA/ RhoA相关蛋白激酶(ROCK)信号通路，进而调节巨噬细胞/MG由具有促血管新生功能的M2型向M1型转化实现的。Cao等[47]对AMD患者的尸检眼检测发现，干性AMD患者玻璃膜M1型炎症因子明显升高，而湿性AMD患者的CNV膜则表现为M2型炎症因子高表达，而其中老年患者M2型表达量高于年轻患者，提示RMG的极化水平受老龄、病程等多种因素影响，其在AMD病理进程中的作用并非单一体现，而平衡RMG M1型/M2型之间的极化水平或许是研究AMD治疗方法的新思路。

3 小结

RMG是存在于视网膜内的主要吞噬细胞，执行免疫监视、清除代谢产物等多种生物学功能，是维持视网膜稳态及视功能的关键成分。RMG在AMD的发生发展过程中也扮演重要角色，早期病理状态下RMG迅速反应，其迁移、增殖、激活、极化等均表现出了明显的特征性改变，对视网膜有一定保护作用，但过度激活造成的炎症环境又可成为AMD进展的推动因素。因此，通过RMG途径治疗AMD的具体机制可能与对多种免疫分子及信号通路的调节有关。RMG的活化与作用在AMD的疾病全程均有明确体现，其M1型/M2型极化间的平衡随病程反复重建，这提示了未来研究及治疗AMD的新方向。