内皮型一氧化氮合酶与心肌缺血再灌注损伤的关系研究进展

魏娜，刘振兵，2

1 内蒙古医科大学鄂尔多斯临床医学院，内蒙古 鄂尔多斯 017000；2 鄂尔多斯市中心医院心血管内科二区

心肌缺血再灌注损伤（MIRI）是指冠状动脉（冠脉）血供减少或中断后造成心肌缺血，待冠脉血运恢复后出现心肌顿抑导致不可逆损伤，导致心肌细胞凋亡或坏死。虽然在心肌缺血期间给予心脏保护干预措施（治疗性低温、迷走神经刺激、远程缺血预适应和美托洛尔治疗等）可减轻MIRI［1］，但疗效有限，还需进一步研究心脏保护策略。内皮型一氧化氮合酶（eNOS）在心肌细胞和内皮细胞表达，可催化底物L-精氨酸生成一氧化氮（NO），发挥心脏保护作用。本文对eNOS与MIRI的关系进行综述。

1 eNOS的来源、结构和功能

eNOS 是血管内皮中最重要的NO 合成酶亚型，是一种同源二聚体，可与多种辅因子结合，将L-精氨酸和氧气转化为L-瓜氨酸和NO。eNOS 的N 末端由加氧酶结构域组成，含有四氢生物蝶呤、血红素铁和L-精氨酸结合部位，以上辅因子可促进酶的二聚化。当L-精氨酸和四氢生物蝶呤缺乏时，eNOS不产生NO 而产生超氧阴离子（O2-），导致氧化应激和内皮功能障碍，最终加剧eNOS 解偶联［2］。每个eNOS单体的两个半胱氨酸残基之间与锌离子形成的硫代锌簇使酶更稳定。但当该簇被氧化或暴露于过量过亚硝酸盐中会导致eNOS解偶联。eNOS与不对称二甲基精氨酸（ADMA）会竞争底物精氨酸，所以ADMA 是内源性的eNOS 抑制物，当其血浆浓度的增加会使eNOS 解偶联，促使氧化应激和内皮功能障碍发生和发展。然而在生理条件下或L-精氨酸充足的情况下不会发生。eNOS 的C 末端是还原酶结构域，可与黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸结合。若要激活eNOS，需两个钙离子激活钙调蛋白，解除其与还原酶结构域相连方可激活eNOS。

eNOS 不仅在内皮细胞中表达，并在心肌细胞、肥大细胞、肾上皮细胞、红细胞、白细胞和血小板中表达，在心血管生理学中发挥混合功能，既可以合成NO，扩张血管，也可以合成超氧化物，加剧氧化应激。

2 eNOS生理作用与MIRI的关系

2.1 解偶联 eNOS 解偶联可加剧MIRI。偶联时，eNOS 产生NO 以促进血液流动，并在血管内皮细胞表面维持抗炎和抗血栓的作用［3］。解偶联时eNOS功能受损，即不生成NO，而是产生O2-，使NO 生物利用度降低，氧化应激增加，并导致或加重内皮功能障碍。抑制eNOS 解偶联包括加入L-精氨酸底物、抑制精氨酸酶以及补充四氢生物蝶呤和叶酸，后者可提高NO 水平［2］。研究证实，在人脐静脉内皮细胞缺氧复氧模型中减少eNOS 解偶联可通过下调O2-和过氧亚硝基阴离子（ONOO-）的生成，提高NO 水平，改善缺氧/复氧诱导的内皮损伤和氧化应激。此外，氧化应激引起的氧化谷胱甘肽水平升高可诱导剂量依赖的eNOS S-谷胱甘肽基化产生，加剧解偶联［3］。其次，解偶联可将运动产生的有益的血管效应转化为血管损伤的关键事件。在内皮腺苷单磷酸活化蛋白激酶α1 缺乏的情况下，运动促进了eNOS 介导的超氧化物歧化酶的产生，过氧亚硝酸盐的形成增加，导致活性氧大量生成，并使内皮功能障碍持续存在［4］。抗阻力运动可通过限制eNOS 解偶联增强其活性，将NO 信号转化为远端缺血预处理效应，促进缺血后心肌收缩功能恢复，减少致命性心律失常，缩小心肌梗死面积［5］。综上，eNOS 解偶联会诱导氧化应激及内皮功能障碍加剧MIRI。

2.2 磷酸化 磷酸化是eNOS 活性的关键调节方式。eNOS 的磷酸化和去磷酸化依赖于钙调蛋白的结合和电子从还原酶到加氧酶结构域的流动。eNOS 被磷酸化的主要部位是丝氨酸残基（Ser），其次是酪氨酸（Tyr）和苏氨酸（Thr）残基。Ser617、635和1179 以及Tyr81 的磷酸化导致eNOS 激活，而Ser116 和Thr495、497、Ser144 的磷酸化会使eNOS 活性减弱［6］。MIRI 小鼠模型缺血心肌中亚硝酸盐水平、eNOS 表达和Ser1177 处的磷酸化显著减少［7］。与安静大鼠相比，运动大鼠心脏中eNOS Ser1177 位的磷酸化在再灌注早期显著降低，增加心脏对MIRI的易感性，发挥保护效应［4］。高密度脂蛋白通过增加eNOS Ser1177 磷酸化，增加eNOS 活性并保护血管弹性，进而减轻MIRI［8］。在细胞MIRI 模型中，增加Ser1177 和Tyr81 处磷酸化可促进eNOS 产生NO，从而减轻冠脉内皮功能障碍。远端缺血适应可诱导Tyr81 磷酸化使MIRI 心肌中的eNOS 激活［9］。通心络可增加缺血心肌eNOS Ser1179 和Ser635 处的磷酸化来减轻无复流和MIRI。缺血预处理显著逆转了MIRI诱导的eNOS Ser1177处磷酸化和总eNOS表达的降低，保护血管内皮。无机砷可增强男性eNOS Ser1177 磷酸化水平，减轻MIRI，而女性由于雌激素的内分泌干扰作用无此效应。所以eNOS 的有益磷酸化是确保NO 产生的关键翻译后修饰，通过逆转凋亡、保护血管内皮发挥保护作用。

3 eNOS与MIRI发病机制的关系

3.1 内皮功能障碍 血管内皮作为最直接暴露于MIRI外源性损伤的器官，MIRI可造成血管内皮功能障碍，使eNOS 蛋白表达严重降低，NO 产生减少。MIRI 发生后在冠脉血运重建时会进一步加剧内皮功能障碍［10］。血管内皮功能有大部分经eNOS 的功能和活性决定［8］，NO 不仅是血管扩张剂，也是减少血小板聚集和中性粒细胞黏附的抑制剂，只有通过维持足够的eNOS水平才能改善MIRI引起的内皮功能障碍。沉默信息调节剂1（SIRT1）已被证明可与eNOS 结合，并使eNOS 钙调蛋白结构域中的赖氨酸K496 和K506 去乙酰化，从而促进NO 的产生，重置eNOS 活性。动物实验发现，eNOS 基因敲除的小鼠可导致严重的血管内皮细胞功能障碍，并导致冠心病［11］。第三代β1选择性β受体阻滞剂奈比洛尔可刺激内皮NO 的形成，逆转内皮功能障碍，改善高血压大鼠模型的氧化应激，并防止心肌梗死的多种并发症发生［12］。维生素D缺乏是内皮功能障碍的危险因素。在内皮细胞中，维生素D通过介导eNOS活性来调节NO 合成。在致病条件下，由于活性氧过量产生引起的氧化应激会促进NO 降解、抑制其合成并降低其生物利用度。维生素D抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的活性，使活性氧产生受影响，并通过增强抗氧化酶的活性来提高抗氧化能力［13］。所以内皮功能障碍和eNOS 损伤会相互促进，无法起到扩血管和保护内皮作用，加剧MIRI。

3.2 氧化应激 MIRI 会诱导过量的活性氧物质形成造成氧化应激，后者可对eNOS本身或上下游信号分子中明确定义的“氧化还原开关”进行不利调节。“氧化还原开关”包括：四氢生物蝶呤的氧化耗竭，锌硫络合物的氧化破坏eNOS二聚体，活性氧引发的内源性eNOS抑制物ADMA水平的增加［14］，还原酶区域半胱氨酸残基Cys689 和Cys908 上的S-谷胱甘肽基化［15］，以及Thr495 或Tyr657 的不利磷酸化［16］。导致eNOS 活性丧失，甚至解偶联［6］，后两者会加速衰老。此外，O2-和ONOO-是介导氧化应激、降低的NO 可用性和抑制eNOS 活性的主要自由基，它们会对蛋白质、脂质和DNA 造成氧化损伤。O2-通过增加eNOS解偶联、降低eNOS 蛋白表达、上调eNOS 抑制剂ADMA的形成以及降低辅因子四氢生物蝶呤的生物利用度，造成NO合成减少；ONOO-可诱导eNOS蛋白的构象破坏最终加剧O2-产生。在大鼠心肌梗死模型中，抑制ONOO-可减少心肌损伤。紫檀芪通过抑制氧化或硝态应激来减轻MIRI。糖尿病通过抑制eNOS 磷酸化表达、降低NO 可用性和增加血管收缩因子内皮素-1 用量诱导氧化应激，导致内皮功能障碍［17］。细胞水平的氧化应激在心肌梗死后的心肌重构中也起关键作用。动物实验表明，在过度表达eNOS的转基因小鼠中，心肌梗死后的心肌重构减弱、血管生成增加、心肌纤维化减少。细胞实验表明，受到过氧亚硝酸盐或次氯酸的攻击时，可使eNOS解偶联［18］。其次，NO生物利用度降低也是氧化应激造成的结果。硝酸异山梨酯通过清除过氧亚硝酸盐替代NO防止有机硝酸盐诱导的氧化应激［12］；NO的过量生成和过氧亚硝酸盐的生成可导致基质金属蛋白酶-2的激活，降解肌钙蛋白，改善MIRI［19］。综上，氧化应激会开启eNOS氧化还原开关并加重MIRI。

3.3 炎性反应 MIRI 可导致广泛的炎性反应，使细胞因子如肿瘤坏死因子-α 及白细胞介素1、2、6、8和18，黏附分子如血管细胞黏附因子1、细胞间黏附分子1和E-选择素表达增强，介导白细胞滚动、黏附和跨内皮迁移，并引发炎症级联反应［14］。降低eNOS启动子活性后可表现为促炎和促凝状态，eNOS表达和活性降低是对炎症、免疫或代谢损伤的反应，也是内皮功能障碍的特征性表现［20］。一种多功能细胞黏附分子已被证明可维持eNOS 活性和NO 生物利用度，并调节炎症过程中白细胞的外渗［10］。此外，氧化应激和缺氧也可以诱导炎性反应。维生素D通过抑制促炎细胞因子的产生，上调eNOS 活性来抑制炎性反应［13］。动物实验表明，补充四氢生物喋呤可使eNOS 活性增加，降低缺血后心肌中性粒细胞的激活，改善心肌血流灌注。肼丙嗪通过减少炎症因子释放，减轻MIRI 和细胞凋亡［21］。糖尿病可增加MIRI 中白细胞浸润，促使左心室功能不全和梗死面积扩大［17］。其次，eNOS产生的NO，可维持内皮与周围组织之间的稳态，并作为一种有效的抗炎剂，抑制白细胞与血管壁的相互作用，从而减少病理性炎症和血栓形成。在eNOS 基因敲除MIRI 小鼠模型中，白细胞与血管壁的黏附率提高了10 倍，增加NO 后可抑制炎症反应［6］。综上，增加eNOS 活性可抑制炎性反应，减轻MIRI和心肌细胞凋亡。

4 eNOS介导的信号通路与MIRI的关系

4.1 磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）/eNOS 信号通路 PI3K/Akt/eNOS 信号通路是激活eNOS、调节NO水平的主要信号通路。eNOS 主要表达于哺乳动物心肌细胞，是Akt 的下游因子，Akt 使eNOS Ser1177 磷酸化，诱导NO 产生［22］。氢吗啡后处理通过激活该通路，增加Akt 和eNOS 的磷酸化，上调总NO 和硝基酪氨酸的水平，发挥治疗MIRI 的作用。高胆固醇血症可以下调eNOS 的表达，减少NO 的产生，并诱导血管内皮功能障碍，影响冠脉功能［23］。现有证据表明，PI3K/Akt/eNOS 信号通路通过各种干预措施（如延迟预处理、右美托咪定和黄芩苷的应用）在心脏保护机制中起重要作用。在氧化应激方面，MIRI 期间外周阻力血管中过量的活性氧和活性氮可使PI3K /Akt/eNOS 通路变钝，引发内皮功能障碍。缺血预处理通过消除活性氧来减弱由过氧亚硝酸盐介导的蛋白质酪氨酸硝化作用，并激活该通路保护内皮。eNOS基因敲除后可以显著增加心肌对MIRI的敏感性，并消除缺血预处理的保护效应。异黄酮通过激活该通路改善MIRI并减弱的氧化应激。在细胞凋亡方面，肼丙嗪预处理不仅能阻断MIRI 诱导的PI3K、Akt 和eNOS 的磷酸化，还通过该通路抑制心肌细胞凋亡［21］。在炎性方面，激活该同路可增加Akt、eNOS 的磷酸化和NO的生物利用度，减少下游炎症反应，发挥抗炎作用［24］。遂该通路在MIRI 中可发挥抗炎、抗凋亡、抗氧化应激作用。

4.2 SIRT1/eNOS 信号通路 SIRT1 是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性组蛋白去乙酰酶，参与氧化应激及细胞凋亡、分化和衰老的调节。与正常心脏相比，MIRI 时心肌组织SIRT1 表达降低，SIRT1 过表达时可减轻MIRI，所以SIRT1使心脏对MIRI更具抵抗力。SIRT1 是一种强大的调节剂，用于维持eNOS功能和活性形式。SIRT1 与eNOS 具有协同作用，抑制SIRT1 活性可使eNOS 乙酰化并抑制eNOS 活性。SIRT1 可增强糖尿病患者心脏中eNOS 磷酸化，减轻MIRI 和氧化应激［25］。SIRT1 并不是eNOS 的直接上游，SIRT1 通过脱乙酰化赖氨酸496、506 来激活eNOS，使NO 水平升高，增强eNOS 抗氧化应激能力［26］。在大鼠心肌梗死模型中，咖啡酸邻硝基苯乙酯通过SIRT1/eNOS/核因子-κB 途径减少肿瘤坏死因子-α 释放和胶原沉积，激发SIRT1 和eNOS 的表达，增强NO 释放并抑制核因子-κB 信号传导，从而降低丙二醛水平和细胞坏死，发挥抑制氧化应激、炎症反应、纤维化和坏死细胞增多症来改善MIRI，并在缺氧复氧心肌细胞模型中抑制细胞凋亡和活性氧产生来减轻MIRI［27］。姜黄素通过激活SIRT1 信号通路减轻MIRI诱导的线粒体氧化损伤。同样，白藜芦醇通过激活SIRT1 而减少MIRI，而烟酰胺（SIRT1抑制剂）以剂量依赖的方式加重心肌细胞凋亡，表明SIRT1 可以减轻心肌细胞凋亡。SIRT1 刺激核因子-κB、eNOS 脱乙酰化，导致核因子-κB 转录受抑制，使eNOS 活性被促进［27］。此外，SIRT1/eNOS 轴是血管衰老的潜在靶标，血管老化伴随着eNOS 表达或活性降低。与成年人相比，老年人的eNOS 蛋白水平降低，但老年人和儿童之间的eNOS 水平没有显著差异。人源性激肽释放酶结合蛋白通过该信号通路逆转过氧化氢产生，解除对eNOS 和SIRT1 的抑制，发挥抗衰老和抗氧化作用［28］。遂该通路有抗炎、抗凋亡、抗衰老及抗氧化应激作用。

4.3 腺苷单磷酸活化蛋白激酶（AMPK）/eNOS/NO信号通路 AMPK 是一种被视为记录细胞能量水平“电量计”的关键激酶，广泛表达于大脑、心脏、卵巢和子宫以及其他组织中，也是启动自噬的关键分子。eNOS Ser1177 是AMPK 的底物。激活AMPK/eNOS信号通路可加速生成新生血管，特别是在缺血应激条件下。AMPK 活化后使内皮细胞内eNOS 直接磷酸化并发挥保护内皮功能作用。AMPK/eNOS通路也参与缺血性心肌的血管保护。AMPK 通过诱导心肌细胞自噬、减弱内皮细胞应激以及通过eNOS介导的NO 产生来减少心肌耗氧量，从而促进缺血性心肌存活［29］。在MIRI过程中，长期过量或过少的NO代谢产物均对心肌细胞产生不利影响。NO是否作为斑块进展的保护剂，取决于其浓度、伴随的介质和斑块发展的阶段。NO 通过抑制低密度脂蛋白氧化，高密度脂蛋白通过载脂蛋白A 介导对清道夫受体B 型功能的作用，增加NO 的产生［30］。NO 的生物利用度可被eNOS 表达或活性的减少影响，如eNOS解偶联产生O2-，以及通过与O2-反应降解NO，导致ONOO-形成，降低NO 的生物利用率［29］。在心肌细胞缺氧复氧模型中，缺血后处理通过AMPK/eNOS信号通路增加eNOS 和AMPK 的磷酸化来减轻MIRI。在小鼠心肌梗死模型中，缺血后处理可减少心肌梗死面积并改善心室重构。所以该通路通过保护内皮、稳定斑块、调脂和抗氧化应激来减轻MIRI。尽管增加eNOS 有益磷酸化和减少解偶联，有减少内皮功能障碍、抗氧化应激和抗炎作用，并通过PI3K/Akt/eNOS、SIRT1/eNOS、AMPK/eNOS/NO 等信号通路减轻MIRI，但目前仍需多种治疗方法联合作用治疗MIRI，还需深入探究MIRI 的发生机制及涉及通路、调控靶点指导临床治疗。研究eNOS 及其介导的信号通路在MIRI的发生、发展及预后中的作用，对防治MIRI具有重要意义。