PLT-F通道在异常血小板计数检测中的应用进展

史东沙 综述,胡志东 审校

天津医科大学总医院医学检验科，天津 300052

准确的血小板计数对于出血和血栓形成的风险评估、输血决策和恶性血液病的诊断至关重要[1]。目前，全自动血细胞分析仪用于血小板计数检测的准确性仍然饱受争议[2]。在非常低值血小板计数中、存在类似血小板大小粒子干扰的标本及存在异常血小板聚集的标本中，血小板计数的准确性受到挑战。为解决这些问题，血小板特异性单抗(抗CD61、抗CD41)标记技术及多参数的流式细胞术发展起来，然而由于价格昂贵，操作繁琐并没有应用到临床，而是发展为了国际血液学标准化委员会推荐的国际参考方法(IRM)[3]。第二代的光学法血小板计数(PLT-O)可以准确检测大部分的血标本，然而一些低值血小板标本及含有巨大血小板标本中，该系统对于血小板计数检测依然不准确[4]。基于以上原因，荧光血小板(PLT-F)通道应运而生。通过PLT-F通道计数血小板时，血小板用荧光恶嗪染料染色，这种染料与富含核酸的血小板细胞器(如核糖体和线粒体)特异性结合，然后用半导体激光束照射血小板，将血小板的前向散射光和侧向荧光强度绘制在二维散射图上，进行血小板的鉴别和计数[5]。有关影响血小板计数检测准确性的因素主要包括以下两个方面。(1)血小板数量的异常，极低值血小板计数及异常高值血小板计数均会对血细胞分析仪检测血小板计数的准确性提出挑战；(2)各种干扰因素的存在，其中包括血小板计数假性增加的几种情况：红细胞碎片、白细胞胞质碎片、冷球蛋白、脂质及细菌/真菌干扰；血小板计数假性减少的情况：大血小板、血小板聚集和血小板卫星现象。本文将对PLT-F通道在异常血小板计数检测中的应用做一综述，以指导临床实验室测得更为准确的血小板计数。

1 血小板数量异常

1.1PLT-F通道用于低值血小板计数的检测 PLT-F通道对于低值血小板计数的检测是非常出色的，同时测量荧光和散射光使PLT-F通道能更精准的识别血小板，从而得到更准确的血小板计数[6]。激光共聚焦显微镜下，PLT-F通道结果与参考单抗抗CD61和抗CD41的着色特异性高度吻合，而该试剂对血小板膜和红细胞碎片的薄膜均为弱着色，这一点明显优于PLT-O通道[4]。PLT-F通道的分析标本量约为常规方法的5倍，即使血小板计数较低的标本，也可获得高精度的数据[5]。PLT-F通道计数血小板的基本性能在批内重复性、线性和相关性方面均令人满意，与IRM的相关性也非常高(r>0.99)。且PLT-F通道在确定患者是否需要输注血小板方面效果是出色的，PLT-F通道在检测血小板计数为10×109/L和20×109/L的灵敏度分别为95.8%和98.2%，远高于PLT-I通道[7-8]。TANTANATE等[9]报道在急性白血病患者中相对于PLT-I通道及贝克曼库尔特LH780血细胞分析仪，PLT-F通道在低值血小板计数检测中的平均偏差最小，为 2×109/L。一些研究证实相对PLT-I通道，PLT-F通道的精密度和准确度均有提高[10-11]；也有研究报道，PLT-F通道表现出可接受的不精密度(<4%),尤其是在低值标本中，但是相比于PLT-I通道并没有显著降低[7]。多项研究评估了PLT-F通道在准确检测低值血小板方面的性能[3,11- 12]，这些研究报道，PLT-F通道是一种可靠的低值血小板计数方法，是血小板减少患者合理选择血小板输注的首选方法。因此，对于血小板减少患者，尤其是血小板计数在血小板输注阈值附近的患者，推荐采用PLT-F通道来检测血小板计数。

1.2PLT-F通道用于异常高值血小板计数的检测 血小板计数连续两次大于450×109/L时通常被认为是血小板增多，血小板增多是医学实验室中常见的现象[13]。准确检测血小板增多对恶性血液病(如原发性血小板增多症)的诊断和出血及血栓风险评估也很重要[14]。而PLT-F通道在血小板增多中的性能仍存在争议。SUN等[15]研究显示在血小板增多方面，PLT-F通道(r=0.831)与IRM的相关性低于PLT-I通道(r=0.960)，PLT-F和PLT-I通道数值均呈现低于IRM数值的趋势，而TANTANATE等[16]发现，对于有血小板增多的标本，PLT-F与IRM的符合率为98%，高于PLT-I与IRM的符合率(89%) 。但二者的研究均显示在检测高值血小板计数方面，PLT-F通道的特异度高于PLT-I通道，而灵敏度低于PLT-I通道。而文献[11]评估显示，PLT-F通道在检测高值血小板计数方面，灵敏度和特异度均高于PLT-I通道，且二者检测的血小板计数均高于IRM检测的血小板计数。故PLT-F通道在血小板增多标本中的作用并没有在血小板减少中那么优越，目前研究比较一致的是其检测出血小板增多的特异度优于PLT-I通道，而灵敏度是否优于PLT-I通道仍有待更多的临床研究证实，PLT-F通道检测血小板计数高于还是低于IRM检测结果的说法也不一致，故临床实践中，对于血小板增多标本，是否采用PLT-F通道复查有待商榷，而更应该做的是血涂片染色镜检，排除干扰因素导致假性血小板增多的可能。

2 各种干扰因素

2.1血小板计数假性增加

2.1.1红细胞碎片和小红细胞干扰 PLT-F通道采用荧光恶嗪染料对RNA染色结合流式细胞技术进行分析，血小板的荧光强度较高，可与小红细胞和红细胞碎片区分开来。在平均红细胞体积小于65 fL的小红细胞标本中，PLT-F通道仍能得出准确的血小板计数[17]。人工制备破碎的红细胞，按比例加入纯富血小板血浆上机检测，结果显示在混有红细胞碎片的标本中，PLT-F通道仍可以得到较为准确的血小板计数，明显优于PLT-I和PLT-O 通道[4]。对于烧伤患者血小板计数变化的监测显示，在烧伤发生的前3天，由于红细胞碎片的存在，PLT-I和PLT-O通道检测的血小板计数与IRM检测的结果有很大差别，而PLT-F通道检测到的血小板计数与IRM检测的结果始终一致[2]。在富含小红细胞和红细胞碎片的珠蛋白生成障碍性贫血患者中，PLT-F通道也与IRM有良好的相关性[16]。另外有多篇病例报告显示，在临床实践中，PLT-F通道可有效纠正红细胞碎片和小红细胞的干扰，在正常红细胞散点的下方出现弱侧向散射光和较强前向散射光的碎片红细胞散点区域，其中包括珠蛋白生成障碍性贫血患者极小红细胞干扰,以及弥散性血管内凝血患者、骨髓纤维化患者红细胞碎片干扰[18-20]。故对于存在小红细胞和红细胞碎片的标本，PLT-F可以作为反射试验，以获得相对准确的血小板计数。

2.1.2有核细胞胞质碎片 除了红细胞外，有研究报道一些异常细胞的胞质碎片也会导致血小板计数假性增加，这些几乎都是由原始细胞或淋巴瘤细胞产生的小碎片[21]。类似于红细胞碎片，当大量出现时，它们有时可以使血小板计数假性增加。单核细胞白血病和弥漫大B细胞淋巴瘤是这种罕见干扰最常见的原因[22]。急性白血病时，原始细胞的存在是干扰阻抗法血小板计数的独立因素，这种干扰可能与原始细胞产生的胞质碎片有关，而PLT-F通道检测的血小板计数更接近IRM的结果[9]。然而值得注意的是在白血病患者标本中，原始细胞胞质碎片的干扰导致的结果很少是血小板计数增多，更常见的情况是，它们掩盖或部分纠正了血小板计数减少，从而延迟了血小板输注。当有出血，但血小板计数没有下降时，临床和实验室医生均应警惕这种假设的存在。TANAKA等[5]对两例存在白细胞碎片的白血病病例分析显示：在PLT-F通道散点图中，白细胞碎片在高荧光强度的未成熟血小板 (IPF)区域上方被视为一个异常的簇，该簇被识别为白细胞，IPF区未被侵入。PLT-F通道检测的血小板计数略低于IRM的结果，并没有发现白细胞碎片的对血小板计数的影响。XN分析仪的结果通常产生其他报警信息(如怀疑大血小板或血小板团)或有关设备无法产生拟合曲线。在阻抗和光学衍射技术中，血小板计数都是扭曲的，PLT-F通道测量更准确[23]。故对于怀疑存在有核细胞胞质碎片干扰标本，PLT-F通道是合适检测血小板计数的方法。

2.1.3其他 冷球蛋白会干扰血细胞计数，并且它们的干扰是大小相关的，小的沉淀物会诱发假性血小板增多或掩盖血小板减少[24-25]。PLT-F通道采用了对血小板RNA染色更精准的荧光染料，可以有效对抗冷球蛋白的干扰，得出正确的血小板计数[23]。PLT-F通道用于测定脂血标本中的血小板计数是可靠的。在含不同水平血小板的非脂血全血标本中各加入400 μL脂肪乳置换等量血浆上机检测，结果显示仅PLT-F通道在高、中、低组中均符合预设的均值偏倚、比例偏倚和截距的95%CI标准。与PLT-I或PLT-O通道相比，PLT-F通道能更准确地反映脂血标本的真实血小板计数[26]。故对于脂血标本及怀疑冷球蛋白干扰标本推荐采用PLT-F通道计数血小板。由于本身比较罕见，有关细菌、真菌干扰对PLT-F通道的影响的鲜有报道。

2.2血小板计数假性减少

2.2.1大血小板 无论是否存在血小板减少症(骨髓增生性肿瘤、骨髓增生异常综合征、遗传性血小板疾病和/或血小板减少症、免疫性血小板减少症等)，在各种情况下均可发现大血小板甚至巨血小板，并常常导致血小板计数被低估，甚至干扰白细胞计数[23,27]。它们的检测对于纠正血小板计数和指导原发性血小板减少症的诊断具有重要意义。相比于PLT-I和PLT-O通道，PLT-F通道可以通过特异性染色血小板内RNA更精准的识别大血小板，从而得出更准确的血小板计数[23]。在PLT-F通道的血小板散点图上，大血小板常常出现在正常血小板的右上方的绿色区域，被识别为IPF，可以和红细胞和白细胞明显的区分开来[3]。在存在大血小板的标本中，PLT-F通道与手工法有较好的一致性[28]。大血小板存在时，XN分析仪通常会有“大血小板”的报警提示，同时血小板直方图会出现翘尾现象，应提高警惕，并及时采用PLT-F通道进行复测。

2.2.2乙二胺四乙酸(EDTA)诱导的血小板聚集及血小板卫星现象 EDTA诱导的血小板聚集在临床并不少见，然而直至2020年仍有病例报道由于EDTA诱导的假性血小板减少导致的不良临床后果[29-30]，其中包括新型冠状病毒感染患者EDTA诱导血小板假性减少导致的不必要的血小板输注[31]。PLT-F通道在血小板聚集的识别和处理方面的价值均有报道。LUNDE等[32]报道，PLT-F通道用于鉴定EDTA诱导的假性血小板减少的诊断准确性非常好，可有效识别血小板聚集，明显优于WDF和WNR通道。 LARDINOIS等[33]最近有关1例多种抗凝剂聚集的病例报道认为，PLT-F、PLT-O通道和IRM可使聚集物部分分离，因而检测得到的血小板计数的最高，而阻抗法是最容易导致血小板聚集的方法。考虑到IRM的技术和时间成本较高，PLT-O通道的变异性较大，荧光血小板计数是最有用的二线技术。光学血小板计数可以使EDTA诱导血小板聚集现象部分解离这一现象也在有些研究中报道，例如Mindray SF-cube平台上加入涡旋技术后采用PLT-O通道可以有效地纠正EDTA诱导的血小板聚集，甚至提出EDTA诱导的血小板聚集可能不再需要另一种抗凝剂[34-35]。尽管如此，更换抗凝剂如柠檬酸钠或肝素采血管仍是目前临床解决这种现象最常用的方法[36]，其他报道的方法包括涡旋混匀[37]，机器旁采血立即上机检测[38]，37 ℃保温上机检测或者是标本中加入阿米卡星、氯化钙、抗血小板药物、叠氮化钾、卡那霉素或其他氨基糖苷[23,39-41]。血小板卫星现象由于临床比较罕见，有关其对PLT-F通道的影响的鲜有报道。

综上所述，在低值血小板计数检测和血小板输注指导方面，PLT-F通道表现出了出色的性能，且可有效纠正红细胞碎片、有核细胞胞质碎片、冷球蛋白、脂质和大血小板对血小板计数的干扰。因此，PLT-F法血小板计数有助于形成更合理的临床决策，并有助于血液学或临床实验室的高效运作[5]。但与常规阻抗法相比，PLT-F通道需要更大的标本体积和更长的计数时间，以及更高的荧光细胞染料成本。因此，不能将PLT-F通道作为每种情况的初始试验。它更适用于作为一个反射试验用于怀疑阻抗法计数不准确的标本。另外由于RNA在室温放置下会降解，因此 PLT-F 通道更适合于新鲜全血的应用[11]。对于血小板增多标本，PLT-F通道并没有表现出明显优势。而EDTA诱导的血小板聚集现象仍是目前影响血细胞分析仪血小板计数准确性的一大挑战，涡旋混匀结合荧光流式血小板计数或许是未来血细胞分析仪的破局方向。