仔鹿感染绵羊链球菌、肠球菌的分离鉴定

王宏图，张金江，冷 婧，赵颖婕，梁蓉蓉，胡建军，敖维平*

（ 1. 塔里木大学动物科学与技术学院，新疆 阿拉尔 843300 ； 2. 阿图什市动物卫生监督所，新疆 阿图什 845350 ； 3. 塔里木大学人文学院，新疆 阿拉尔 843300 ）

塔里木马鹿属新疆马鹿3 个亚种之一，属于新疆特有动物物种资源。人工驯化饲养的塔里木马鹿主要集中在新疆南疆部分农牧团场饲养繁育，仔鹿出生后，饲养管理不当、病原感染等因素可导致仔鹿发病，若治疗不及时导致仔鹿死亡，对养鹿场造成一定经济损失。链球菌的种类繁多、分布广泛，常以共栖菌、致病菌的方式存在于大多数健康动物体内，主要有致病性、非致病性两种类型。引起动物感染发病的主要是链球菌科中链球菌属和肠球菌属的一些成员，动物抵抗力低下时在多种诱因作用下可致动物发病，如各种化脓创、败血症等[1]。肠球菌原为链球菌属的D 群成员，现属于球菌纲、乳酸杆菌目、肠球菌科，是动物肠道内的一种正常菌群，为机会致病菌，可引起人畜共患的多种疾病如败血症、心内膜炎、脑膜炎以及尿路感染；在肠道内可作为转移耐药基因的供体菌，导致一些病原菌产生耐药性，对疾病的治疗造成困难[2-3]。2022年，新疆南疆某规模养鹿场仔鹿出现发病、死亡情况，给养殖场带来了一定经济损失。课题组对仔鹿发病情况进行了调查和采样，通过实验室检测、分析，为该场疾病治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源

病料来自新疆南疆某规模化养鹿场发病仔鹿，无菌采集发病死亡鹿的肺脏、肝脏组织样品，一份低温保存，另一份保存在4%甲醛溶液。病料进行轮状病毒、冠状病毒、牛病毒性腹泻黏膜病毒的抗原检测，结果均为阴性。

1.1.2 试剂与仪器

脑心浸出液（BHI）肉汤、琼脂粉等购自北京奥博星生物技术有限责任公司，抗菌药物药敏纸片（成套药敏纸片）购自杭州微生物试剂有限公司，2×PCR Mix、Trans2K® DNA Marker均购自天根生化科技（北京）有限公司。

SHA-X 恒温摇床（上海智胜分析仪器制造有限公司）、SW-CJ-IBU 超净工作台（上海博讯实业有限公司型号）、TC-5000 PCR 仪（Techne 有限公司）、麦氏比浊管（北京天安联合科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 病理组织学观察

取4%甲醛溶液浸泡的肝脏组织，按照常规组织石蜡切片制作方法，切片染色、镜检，观察组织病理变化。

1.2.2 细菌分离

无菌取肺脏、肝脏组织样品划线接种于BHI琼脂培养基和脱纤维绵羊血琼脂培养基，置37 ℃恒温培养箱内培养18～20 h；挑取单菌落革兰氏染色、镜检。

1.2.3 生化试验

分离株采用全自动微生物分析系统（VITEK 2 Compact）、革兰氏阳性细菌鉴定卡进行生化鉴定。

1.2.4 PCR鉴定

细菌鉴定16S rRNA 通用引物，序列：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'， 5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'，扩增产物长度约为1 470 bp。

16S rRNA PCR 扩增反应体系（25 μL）：2×Taq PCR预混试剂Ⅱ 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、模板2 μL、ddH2O 9.5 μL。

PCR 扩增反应程序：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。经1%琼脂糖凝胶电泳，阳性PCR 产物送至上海派森诺生物有限公司测序。

1.2.5 CAMP试验

在血琼脂平板上以金黄色葡萄球菌作一横线接种，垂直处用32T-1分离株接种一条线，两线不相交且相距0.3～0.5 cm，37 ℃孵育18～24 h后观察结果。

1.2.6 药敏试验

选取17 种临床常用抗菌药物，采用K-B 纸片扩散法进行药敏试验，以抗菌药物药敏纸片试剂盒的判断标准对试验结果进行判定。

1.2.7 动物致病性试验

利用麦氏比浊法将纯化分离株培养18 h 后转移到第一支试管中，制备成约5麦氏浊度的均一浑浊的菌悬液（约10 CFU/mL）。将15只小鼠随机分为3组（试验Ⅰ组、试验Ⅱ组、对照组），每组5只。试验组分别接种两个分离株的菌悬液300 μL，对照组接种等体积生理盐水。观察并记录随着时间的变化，小鼠的精神状态及生理反应情况。

2 结果与分析

2.1 肝组织病理学观察（见图1）

由图1可知，肝窦扩张充血，出现大量红细胞，嗜中性粒细胞和灶性炎细胞浸润，肝索变细、排列紊乱，小叶间结缔组织变性、坏死及溶解。

图1 肝组织病理学观察Fig.1 Histopathological observation of liver

2.2 分离株革兰氏染色镜检结果（见图2）

由图2（a）可知，绵羊血平板带有β溶血环的菌落呈灰白色、不透明、表面光滑，革兰染色阳性，无荚膜，呈球形链状排列，直径0.5～1.0 μm，命名为32T-1株。

由图2（b）可知，菌落镜检可见部分呈椭圆短链状排列的革兰阳性菌，命名为32T-2株。

图2 分离株革兰氏染色镜检结果Fig.2 Result of gram stain microscopic examination of isolates

2.3 CAMP试验结果

结果显示，金黄色葡萄球菌存在时，在两接种线之间出现半圆状的溶血区，产生了较明显的β型溶血现象。

2.4 生化鉴定结果

结果显示，分离株纯培养物经全自动微生物分析系统（VITEK 2 Compact）检测，32T-1 分离株与链球菌相似性达96%，32T-2分离株与肠球菌相似性达96%。

2.5 分离株PCR测序结果（见图3～图5）

图3 分离株PCR检测结果Fig.3 PCR detection results of isolates

由图3可知，16S rRNA通用引物对分离株进行PCR扩增，得到与预期结果一致的1 470 bp的片段。

由图4 可知，将32T-1 分离株测序结果与GenBank 中的基因序列进行比对分析，与绵羊链球菌参考株（GenBank登录号：MT545017、MF326229、JQ411243、KE752835 等）核苷酸同源性达到99.8%以上，在系统进化树上为同一分支。

图4 32T-1分离株16S rRNA部分序列的核苷酸系统进化树Fig.4 Nucleotide phylogenetic tree of 16S rRNA partial sequences of 32T-1 isolate

由图5 可知，32T-2 分离株测序结果与肠球菌参考株（GenBank登录号：OP881890、OP890221等）的核苷酸同源性达到99.8%以上。

图5 32T-2分离株16S rRNA部分序列的核苷酸系统进化树Fig.5 Nucleotide phylogenetic tree of 16S rRNA partial sequences of 32T-2 isolate

2.6 药敏试验结果（见表1）

由表1 可知，32T-1 分离株对哌拉西林、羧苄西林、氨苄西林、麦迪霉素、亚胺培南等敏感，对环丙沙星、头孢唑啉、红霉素中度敏感；对青霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、头孢氨苄、头孢拉定、头孢曲松、多西环素、克林霉素、复方新诺明等耐药。

表1 药敏试验结果Tab.1 Drug sensitivity test

32T-2分离株对头孢唑啉、哌拉西林、羧苄西林、氨苄西林、亚胺培南等敏感，对环丙沙星、麦迪霉素、多西环素、红霉素、克林霉素中度敏感；对青霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、头孢氨苄、头孢拉定、头孢曲松、复方新诺明等耐药。

2.7 动物试验结果

结果显示，接种32T-1 分离株的试验Ⅰ组小鼠在24 h后出现死亡现象；试验Ⅱ组接种32T-2分离株的小鼠出现精神不振、萎靡情况，48 h 后恢复正常，未出现死亡现象；对照组小鼠均未出现异常。

3 讨论

本研究结果显示，从发病死亡的仔鹿组织中分离到两株革兰阳性菌，经生化试验、PCR鉴定、核苷酸同源性比较分析、动物致病性试验等，确定分离菌株为β 溶血性绵羊链球菌、粪肠球菌，并且排除了轮状病毒、冠状病毒、牛病毒性腹泻黏膜病毒的感染。

致病性链球菌可通过呼吸道、受损皮肤和黏膜等途径进入动物机体。其中，β溶血性链球菌所产生的透明质酸酶有利于菌体在组织内扩散、蔓延，进入血液引起菌血症。链球菌可感染多种动物，流行病学上的表现也多种多样[1]。颜思通等[4]报道，一批进口羚羊、长颈鹿在检疫期发病、死亡，经诊断为肺炎链球菌。邓汝森等[5]报道，广东省一规模化猪场突然发生散发性急性死亡，随后经细菌的而分离鉴定、PCR 鉴定及生化鉴定等实验室检测，确定分离菌为马链球菌兽疫亚种。陈永林[6]对一例死亡鹿组织进行细菌分离鉴定，确定该鹿链球菌病病原为兰氏C群链球菌。其他学者也开展了大量的鹿链球菌病诊治研究工作[7-12]，为鹿链球菌病防治提供了宝贵的经验。此外，国内也有多位学者开展了绵羊链球菌诊治的研究报道[13-16]，为绵羊链球菌病治疗积累了经验。冯旭飞等[17]研究报道了西藏地区绵羊感染链球菌的情况，表明溶血性链球菌引起绵羊肺炎的病原菌之一。链球菌病作为人畜共患病对畜牧业造成的经济损失已引起广泛重视。

本研究分离获得的一株β溶血性绵羊链球菌，通过动物致病性试验表明该分离株具有强致病性。课题组在前期的流行病学调查中发现，该养鹿场饲养50余只绵羊，马鹿与羊分栏饲养，但两者相距较近。在发病死亡仔鹿体内分离到β溶血性绵羊链球菌，尚无法确定该病原是由羊传染给仔鹿，还是仔鹿自身存在该菌。由于本研究缺乏羊群中致病性链球菌流行病学调查资料，因而需要进一步开展流行病学调查、相应检测加以验证。本研究结果也提示，鹿与羊在同一养殖场混养，势必会增加动物疫病相互感染的风险。因此，在畜牧养殖过程中，不同物种混合饲养应该加强疫病防控意识。

肠球菌属中的某些成员如粪肠球菌及屎肠球菌，普遍认为无致病性，甚至有些分离株还作为微生态制剂加以利用[1]。但人类的肠球菌可致院内感染，甚至在肠道中可转移耐药性基因而成为供体菌，携带的耐药性基因可导致其他病原菌产生耐药性，加大疾病治疗难度[18]。本研究中所分离的肠球菌在动物致病性试验中虽未表现出强致病性，但肠球菌可携带耐药性基因作为供体菌应引起高度重视。

目前，养殖场普遍存在病原菌对抗生素产生耐药性的问题。为提高疾病治疗效果，本研究对分离株开展了药敏试验，筛选出哌拉西林、羧苄西林、氨苄西林、麦迪霉素、亚胺培南等敏感药物，环丙沙星、头孢唑啉、红霉素等中度敏感药物，但分离株对青霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、头孢氨苄、头孢拉定、头孢曲松、多西环素、克林霉素、复方新诺明等抗生素具有耐药性。本试验结果为当地养鹿场仔鹿疾病治疗提供了参考。

4 结论

本研究结果表明，新疆南疆发病仔鹿存在β溶血性绵羊链球菌和肠球菌混合感染，病原鉴定、药敏试验为仔鹿疾病治疗和预防提供了理论参考。