鲤科鱼的HPLC指纹图谱建立及聚类分析和主成分分析

杜强，吴林菁*，曾圣，陈飞雄，赵飞，王艳艳

1.贵州省农业科学院水产研究所（贵阳 550025）；

2.贵州省特种水产工程技术中心（贵阳 550025）；3.贵州医科大学（贵阳 550025）

鲤科鱼（Cyprinidae），属鲤形目，全世界共有鲤科鱼类210属3 700种以上。鲤科鱼类分布在底栖或水中层，为卵生，杂食、草食或肉食鱼类，是鱼类中分布最广、种类最多的一个科目[1]。我国自古有养殖鲤科鱼的历史，特别是在《中华人民共和国渔业法》确立“以养为主”的渔业发展战略以来，极大地促进养殖技术发展，养殖产量和出口规模大幅提高，在水产品养殖和出口贸易中占据重要地位[2]。21世纪以来，中国水产养殖业快速发展，据2020年《中国渔业统计年鉴》数据，鲤科鱼养殖产量超过全国淡水养殖主要鱼类总产量的76%，是中国水产养殖主要品种[1]。伴随着水产养殖规模的不断扩大，随之出现品质不一等问题，这一定程度上制约了水产养殖业的整体发展。

水产品的品质质量分析主要依靠单项指标按照国标检测分析，该定量分析方法在全面反映其品质方面稳定性存在不知。相较于单项指标检测，逐一检测分析所需试验试剂较多、操作者判别差异及较长试验周期，指纹图谱结合色谱和光谱等技术能获得水产品品化学成分的特征谱图，是水产品产地鉴别、真伪鉴别、优劣鉴别的有效工具，还可用于生产过程的质量控制，包括追踪化学成分的变化、监测各批次产品质量的一致性和稳定性[3-4]。高效液相色谱是研究指纹图谱应用最广泛的方法之一，具有分离效能高、分析速度快及仪器自动化等特点，被应用于大多数的非挥发、热不稳定的化合物的研究，被广泛应用于动植物药材品质研究中[2-3]，在部分特色水产品[如大黄鱼（Larimichthys crocea）、马粪海胆（Hemicentrotus pulcherrimus）和鲍鱼（Abalone）等][4-8]的质量控制和产地溯源中也可见报道。

因此，试验通过检测部分鲤科鱼样品，建立相关鲤科鱼HPLC指纹图谱，并通过聚类分析、主成分分析对其质量进行评价，旨在为水产品质量综合评价分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国）；EYELA FD-1000真空冷冻干燥机[西崎贸易（成都）有限公司]；KQ-250B超声清洗机（上海五久自动化设备有限公司）；BSA323S电子天平（上海皖衡电子仪器有限公司）。

甲醇、乙酸乙酯[均为分析纯，科密欧试剂公司（天津）]；乙腈[色谱纯，天地公司（美国）]。试验所用样品经贵州省水产研究所李正友研究员鉴定为鲤科类鱼Cyprinus，分别采集于贵州省内遵义、铜仁、毕节等地（表1）。

表1 鲤科鱼的来源、相似度

1.2 色谱条件

采用Diamousil plus C18-A（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相，进行梯度洗脱：0～7 min，38% A；7～15 min，38%～81% A；15～35 min，81%～94% A；35～40 min，94%～100% A。在波长230 nm、进样量20 μL、柱温30℃、流速0.6 mL/min条件下进行检测。

1.3 供试品溶液的制备

将鱼体背部肌肉冷冻干燥24 h后，打粉过0.250 mm孔径（60目）筛；称取1 g肌肉粉末，用乙酸乙酯定容至50 mL，超声提取30 min，过滤，滤液水浴60 ℃挥干溶剂，取10 mL乙腈溶解滤渣，超声萃取20 min，按5 000 r/min离心10 min，取上清液过0.46 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

1.4 方法学考察

参照以往对HPLC图谱研究方法，按表2分别进行相关项目。

表2 HPLC指纹考察项目及结果

接表2

2 结果与分析

2.1 指纹图谱的建立

将记录好的13批鲤科鱼肌肉供试品（溶液）HPLC图谱以一定格式（AIA）顺序导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A版》[9]软件，以S1号样品的图谱为参照图谱，时间漂移值设定为0.1，选用中位数法自动匹配谱峰，并生成相关图谱（图1）。所得图谱中，以共有的15号色谱峰为参比峰，以其保留时间为1，选择峰面积较大峰位较居中的图谱，确定18个共有指纹峰，并对其相对峰面积和相对保留时间进行计算（SRSD值均＜3.0%），符合指纹图谱的分析要求[10]，见表3和表4。

图1 试验鲤科鱼的HPLC对照图谱（A）及叠加特征图谱（B）

表3 试验鲤科鱼指纹图谱共有峰相对保留时间

表4 试验鲤科鱼指纹图谱共有峰相对峰面积

接表4

2.2 相似度评价

以对照图谱的相似度为1，分别对照样品HPLC图谱的相似度（结果见表1）。与对照组图谱相比，13批鲤鱼样品的相似度在0.861～0.990之间，表明各产地鲤鱼品质相对稳定，如图1叠加HPLC特征图谱所示，试验鲤鱼的主要组成成分基本相同，但各组成成分在含量上有一定的差异。其中样品S5，S7和S8（贵州惠水）的相似度比较低，另外9个批次的鲤科鱼相似度较高（相似度＞0.9）。

2.3 聚类分析

聚类分析是一种广泛应用于植物、中药材、动物鉴别、品种分类和质量评价等方面的研究分析方法[11-12]，通过该方法探讨对比试验样本之间的相关度及品质差异是常用的研究手段。

从指纹图谱中共有色谱峰代表分析样品均含有的化学成分，所在峰面积表示相应的成分含量。试验采用组间连接法，通过余弦距离计算样品间距离，在SPSS 19.0软件中将各样品共有峰面积作为变量导入，对13批鲤科鱼样品运行系统聚类分析，结果如图2所示。判别条件距离为25时，试验所分析的13批鲤科鱼样品被分为两类，其中S5，S6，S7，S8和S13聚为一类，其余8个产地样品归为另一类。因此，采用HPLC指纹图谱，结合聚类分析和相似度分析可为初步判断所用鲤科类所属种类提供参考，但未能区分不同产地的鲤科鱼。

图2 鲤科鱼HPLC 指纹图谱共有峰峰面积的聚类分析

2.4 主成分分析

2.4.1 主成分因子特征值、方差贡献率分析

采用SPSS 19.0软件对试验样品主成分因子分析，结果见表5。以特征值＞1为标准，其中前5个主成分因子的特征值分别为9.025，2.675，2.225，1.287和1.040，方差贡献率分别为50.141%，14.861%，12.361%，7.152%和5.778%，累积方差贡献率为90.292%＞90%，说明通过引用前5个主成分即可代表样品94%以上的信息，证明该组数据有突出的成分可以依据，适用于主成分分析。故通过前5个主成分因子分别对13批鲤鱼样品的共有成分进行评价，详见表6。由表6可知，主成分因子1可反映成分9，10，11，12，13，14，15，16，17和18的信息，主成分因子2可反映成分1，2，3，4和6的信息，主成分因子3可反映成分2，3和9的信息，主成分因子4可反映成分1，7，8和9的信息，主成分因子5可反映成分4和8的信息。以上述因子作变量绘制载荷图（图3）。由图3可知，载荷图结果与初始因子载荷矩阵结果相同，距离原点较远的点为主成分因子1，2，3，4和5中权重值较大的成分。

表5 5个主成分因子的特征值和方差贡献率

表6 旋转后的主因子载荷矩阵表

图3 载荷图

2.4.2 综合质量评分

通过5个主成分因子对13批鲤鱼样品进行综合评分，结果见表7。主成分因子综合得分（major factor synthesis score，MFSC）中S9号鲤鱼样品（正安县正南河）最高，该批样品中1和9～18共11个主成分的含量相对较高，相对而言整体质量较好[13]。

表7 主成分因子得分及排序

3 讨论

3.1 提取方法的考察

参照水产品指纹图谱相关研究，试验对70%甲醇、甲醇、乙醇等6种提取溶剂进行筛选，得出以乙醇提取的样品溶液图谱出峰信息量较大，且基线较为平稳。考察回流和超声提取2种提取方式，结果表明2种方式得出的色谱图差异不大，由于回流提取耗时较长、步骤较繁琐，所以选定超声方法进行提取；超声提取方面，考察30 min（超声1次），50 min（超声2次，第1次30 min、第2次20 min）以及120 min（超声4次，每次30 min）3个提取时间，对比得出超声提取80 min（超声2次，第1次30 min、第2次20 min）的提取效果图谱信息更完整。

3.2 色谱条件的优化

试验通过对比乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.01%磷酸这4种流动相洗脱体系，得出以乙腈-0.01%磷酸体系的效果较好（色谱峰的峰形和分离度较好、色谱峰较多）。比较2种高效液相色谱柱Diamousil plus C18-A（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Agilent ZORBAX SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）的色谱图，结果显示Diamousil plus C18-A（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱的分离度和峰形效果较好，图谱基线较平稳。分别考察柱温20～35 ℃时对色谱峰分离度的影响，得出柱温30 ℃时效果较佳。比较流速0.6～1.2 mL/min对色谱图峰形的影响，结果以0.6 mL/min时的峰形更对称。对波长210，230，254，280，310和360 nm进行考察，对比得出在230 nm下图谱中各色谱峰响应值更高，基线较为平稳，整体信息更全面，故选择230 nm作为检测波长。

3.3 相似度、聚类分析及主成分分析讨论

来源于不同产地的鲤科鱼HPLC指纹图谱有18个共有峰，从结果来看，三者（相似度、得分图及综合得分）相互印证，相似度较低的S7样品（贵州惠水县养殖的黄河鲤），得分图中较离群，综合得分较差，排名靠后。结合得分图情况，13批鲤科鱼主成分有一定差异，同一品种不同产地的样品鱼如S3和S12（野生裂腹鱼）存在一定差异，而同一品种在不同产地的样品鱼如S1和S9、S5和S13（中华倒刺鲃、清水江鲤）的品质相似，同一品种、同一地点的样品鱼如S5和S13（清水江鲤）相似度存在差异。这与聚类分析结果有一定差异，原因可能是主成分分析以绝对峰面积为主，而聚类分析主要是以相对峰面积为主。当然，鱼类品质的影响因素是多方面的，比如环境、饵料、生长年限等，因此建立水产品特有专属性和特征性的评价体系是很有必要的。综合此次试验聚类分析和主成分分析的结果，结合图谱峰面积数据，可把这13批鲤科鱼分为三类，第一类为S1，S8和S9，第二类为S4，S10，S11和S12，第三类为S2，S3，S5，S6，S7和S13。相对来说此次试验样品鱼品质质量排序为第一类＞第二类＞第三类。

3.4 鲤科鱼指纹图谱评价

影响水产品品质的因素主要包括种质特性、养殖环境、饲喂饵料及生理状态[14-15]。鲤科鱼类是我国养殖的主要经济鱼类之一，而由于遗传品种及养殖技术等差异，市场上售卖的鲤科鱼的口感和价格差异较大，在此过程中难免出现滥竽充数，将养殖品作为野生品出售的情况，这严重影响了市场的合理发展。因此，对于水产品尤其是特色经济鲤科鱼类建立一种可行的方法来判断区别鱼类品质和质量控制很有必要。随着人类社会对水产品需求量的增大及食品安全意识的加强，水产品品质质量控制越显重要。结合以往关于有效的食药品质量控制模式研究，指纹图谱作为因具有科学的理论依据和实践累积获得食品药品质量控制业界的一致认可[16-17]。指纹图谱的优势在于在主成分未明确情况下，仍可以得到可靠充分的含量类别和数量信息，从而控制食药品质量[18-19]。根据相关文献[20-25]报道，不同生长环境和养殖方式的水产品在脂肪酸、磷脂等成分含量方面差异明显，而这些差异在HPLC图谱中有所体现，这与以往对其他水产品的研究中得出的结果相同。所以，HPLC指纹图谱可以很好地弥补常规品质质量控制方法的缺陷，应用于水产品的产品质质量控制。

4 结论

试验根据鲤科鱼肌肉中化学组成物质种类和含量差异建立其指纹图谱，结合相似度分析、聚类分析，为鲤科鱼品质质量评价提供参考。在特色经济鲤科鱼的养殖销售过程中，能较好地区分养殖品质量，规范水产品行业发展。然而，试验所用的样品数和产地来源相对较少，具有一定局限性，后续可通过扩大样本量，收集全国各地不同产地样品，进一步完善相关试验因子，从而对鲤科鱼的质量进行更全面的评价和控制，更好地为水产业健康发展保驾护航。