QuEChERS-UPLC-MS/MS同时测定植物源保健食品中15种农药残留

耿熠博，袁利杰*，王祥，郭立净

1.河南省食品检验研究院（郑州 450003）；2.国家市场监管重点实验室（食品安全快速检测与智慧监管技术）（郑州 450003）；3.特殊食品工程技术研究中心（郑州 450003）

随着经济的发展和人民生活水平的提高，人们对养生保健的需求日益增多，许多保健食品应运而生[1-3]。植物源保健食品是以药食同源类中药材为原料的保健食品，使用较多的原料有决明子、白芍、芦荟、三七、菊花、枸杞等。

近年来，随着中药材种植面积的扩大，不少种植户盲目喷洒化学农药，亦或者通过土壤、水体转移、富集农药，造成保健食品原料的污染[4-10]。2019年8月16日，国家药典委发布《0212药材和饮片检定通则公示稿》，规定禁用33种农药[11]，但是缺少保健食品中农药残留的相关标准规定。

国内外对农药残留的文献报道中，检测方法主要包括液相色谱法（liquid chromatography，LC）[12-14]、气相色谱法（gas chromatography，GC）[15-18]、液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS）[19-21,28]、气相色谱-质谱联用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[22-25,29]和气相色谱三重四极杆质谱[26-27]。由于植物源保健食品基质复杂，会产生较强的基质干扰，试验以市场上常见的6类保健食品作为研究对象，选择15种监测风险较高的农药残留进行研究，以常见的3种剂型，即片剂、胶囊和液体为基质，旨在建立一种简单、快捷的检测方法，以满足大批量样品检测，同时为植物源保健品农药残留的检测提供方法依据，为植物源保健食品的质量控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

根据国家食品安全监督抽检实施细则，在河南省不同区域采集131批次保健食品样品，包括通便类49批次、减肥类8批次、清咽类35批次、缓解体力疲劳/增强免疫类8批次、降血糖/降血压类19批次、促进消化类12批次，采样地点为生产企业的成品库，流通环节的网购、批发市场、专卖店、药店、超市和其他。

1.2 仪器与设备

Agilent 1290-6470超高效液相色谱-串联质谱仪[安捷伦科技（中国）有限公司]；4-16KS高速冷冻离心机（德国SIGMA）；ME203电子天平、Mettler XS205电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；UMV-1多管振荡器（成都莱普科技有限公司）。

1.3 材料与试剂

15种农药标准物质：3-羟基克百威、吡虫啉、多菌灵、吡蚜酮、啶虫脒、涕灭威砜、唑虫酰胺、灭多威、霜霉威、敌百虫、甲氨基阿维菌素（100 μg/mL，农业部环境保护科研监测所）；甲基硫菌灵（97.6%）、硫线磷（98.2%）、噻虫嗪（99.4%），德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；辛硫磷（99.8%，北京曼哈格生物科技有限公司）。

甲酸铵、甲酸、甲醇（质谱纯，德国Merk公司）；无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠二水合物、柠檬酸二钠倍半水合物、乙酸钠（分析纯，上海麦克林生化科技有限公司）；0.22 μm滤膜（有机系，天津市领航实验设备股份有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 样品前处理

1.4.1.1 片剂

称取2 g粉碎后试样于50 mL离心管中，加入10 mL水涡旋，静置30 min。加入10 mL 1%乙酸-乙腈及1颗陶瓷均质子，振荡1 min，加入6 g无水硫酸镁和1.5 g乙酸钠，再次剧烈振荡1 min后，以5 000 r/min离心5 min，移取2 mL上清液至净化管中[每毫升提取液使用150 mg无水硫酸镁、50 mg C18和50 mgN-丙基乙二胺（PSA）]，上清液过微孔滤膜，待测定。

1.4.1.2 胶囊剂（内容物）

称取2 g试样于50 mL离心管中，加入5 mL水、10 mL 1%乙酸-乙腈及1颗陶瓷均质子，振荡1 min后加入4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠二水合物和0.5 g柠檬酸二钠倍半水合物，再次振荡1 min后，以5 000 r/min离心5 min。移取2 mL上清液至净化管中（每毫升提取液使用150 mg无水硫酸镁、50 mg C18和50 mg PSA），上清液过微孔滤膜，待测定。

1.4.1.3 液体

准确称取2 g试样，置于50 mL离心管，用1%乙酸-乙腈定容至10 mL，过微孔滤膜，待测定。

1.4.2 基质标准溶液的制备

将15种标准物质用甲醇溶解或稀释，配制成质量浓度均为1 μg/mL的标准品混合使用液。选择不含有目标检测物的类似样品，按照试验前处理方法处理，得到空白基质溶液。精确吸取一定量混合标准溶液，用空白基质溶液，将其稀释成质量浓度为0.001，0.002，0.005，0.010，0.020，0.050和0.100 μg/mL的系列基质匹配标准工作液。

1.4.3 仪器条件

1.4.3.1 色谱条件

色谱柱C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱温35 ℃；进样体积2 μL；流速0.3 mL/min；流动相A为2 mmol/L甲酸铵-甲酸水溶液，流动相B为2 mmol/L甲酸铵甲醇溶液；梯度洗脱：0～1.5 min，5% B；1.5～3.5 min，5%～30% B；3.5～5.5 min，30%～95% B；5.5～7.5 min，95% B；7.6 min，5% B。

1.4.3.2 质谱条件

离子源类型为电喷雾离子源；扫描方式为正离子；电喷雾电压为正离子5 500 V；离子源温度350 ℃；雾化气0.345 MPa。15种农药的质谱信息见表1。

接表1

2 结果与分析

2.1 仪器分析条件的优化

试验考察Agilent ZOBAX XDB C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Phenomenex C18110Å（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）3个品牌的C18色谱柱，结果发现分离度均比较好，没有显著性差异。

分别选取0.1%甲酸溶液和0.1%甲酸溶液（含2 mmol/L甲酸铵）作为水相，甲醇、乙腈、甲醇（含2 mmol/L甲酸铵）和乙腈（含2 mmol/L甲酸铵）作为有机相进行考察，结果发现，流动相为0.1%甲酸（含2 mmol/L甲酸铵）溶液和甲醇（含2 mmol/L甲酸铵）时，各物质响应强度明显高于流动相为0.1%甲酸水溶液和纯有机相的强度，且峰型拖尾现象得到明显改善；与乙腈作为有机相相比，甲醇能在更短时间内使待测组分得到有效分离。因此，试验选择0.1%甲酸（含2 mmol/L甲酸铵）溶液和甲醇（含2 mmol/L甲酸铵）为流动相进行梯度洗脱，标准物质提取的离子色谱图见图1。

图1 标准物质提取的离子色谱图

提取的离子色谱图显示，15种农药的保留时间处均没有干扰峰，表明方法专属性较强。在阴性样品中添加15种农药，质量浓度均为100.00 μg/L，按照1.4.1操作，15种农药提取的离子色谱图分离良好，单次测定15种农药在8 min之内完成分离。

2.2 提取溶剂的选择

试验考察水、甲醇、乙腈、乙醇、1%甲酸-乙腈、1%乙酸-乙腈、1%氨水-乙腈7种提取溶剂体系，通过在植物源保健食品的片剂、胶囊剂和液体3种空白基质中加入适量标准溶液，计算回收率，结果见图2。结果表明胶囊剂和液体剂型的植物源保健食品中乙腈和1%甲酸-乙腈的提取回收率没有差异，均能达到80%以上。对片剂样品，1%甲酸-乙腈的提取回收率优于乙腈的回收率。综合考虑，选择1%乙酸-乙腈为提取溶剂。

图2 不同提取方法对于片剂保健食品的15种农药的回收率

2.3 净化步骤的优化

试验考察C18、PSA净化材料单独使用与组合使用对待测物回收率的影响。因液体保健食品基质相对较简单，故不对其进行净化，仅对片剂和胶囊的净化效果进行考察。具体步骤：在2.2小节的优化提取条件下，提取完成后以10 000 r/min离心，取上清液至装有150 mg无水硫酸镁和不同净化材料的2 mL离心管中，涡旋离心后过滤膜检测，通过计算15种农药的回收率考察不同净化材料的吸附情况，结果见图3和图4。结果显示，C18与PSA组合使用净化效果较好，最终选择50 mg C18+5 mg PSA作为净化剂。

图3 不同净化材料对于片剂保健食品的15种农药的回收率

图4 不同净化材料对于胶囊保健食品的15种农药的回收率

2.4 基质效应

基质效应是使用LC-MS/MS检测残留应尽量避免的。据文献[30-31]报道，基质效应案式（1）计算。

基质效=A/B（1）

式中：A为在纯溶剂中农药的响应值；B为样品基质中添加的相同含量农药的响应值。

基质效应为1时，表示无基质效应；基质效应大于1时，表示样品基质对目标化合物的测定存在基质抑制作用；基质效应小于1时，表示样品基质对目标化合物的测定存在基质增强作用。通过比较15种农药的基质效应，结果发现除吡虫啉外的所有农药均是较为显著的基质抑制效应（见表2），基质效应的值均大于1，因此为消除基质效应带来的影响，必须采取基质标曲进行校正。

2.5 线性关系及定量限

以定量子离子的色谱图峰面积（Y）为纵坐标，以对应的质量浓度（X，μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，回归方程、线性相关系数、定量限见表2。结果显示，15种农药在0.001～0.1 μg/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数（r2）均大于0.996，可通过线性方程对样品基质中农药含量进行准确定量。15种农药方法定量限（limit of quantification，LOQ）按最低质量浓度点0.1 μg/mL的响应值与空白样品基质中的噪声响应值的10倍计算，结果为0.005～0.02 mg/kg，可满足植物源保健食品中农药的检测。

表2 农药线性方程、基质效应、相关系数以及定量限

2.6 方法准确度和精密度

在不含目标检测物的消化类保健食品片剂中添加适量混合标准工作液，分别制成0.005，0.100和0.500 mg/kg 3个水平的空白添加样品，每个添加水平做6次平行试验，以加标的回收率表示方法的准确度，按照试验方法处理分析，分别进行分析测定，15种农药在植物源保健品中不同浓度的回收率及精密度见表3。结果显示，15种农药在0.005 mg/kg的添加水平下，回收率为82%～107.3%，相对标准偏差（relative standard deviation，SRSD）为2.9%～9.1%（n=6），在0.1 mg/kg的添加水平下，回收率为83.5%～101.6%，SRSD为3.5%～8.9%（n=6），在0.5 mg/kg的添加水平下，回收率为92.4%～103.4%，SRSD为2.5%～9.7%（n=6）。在不同的添加水平下，样品基质中的重现性与平行性均较好，可满足多种样品基质大批量检测的需求。

表3 农药加标回收率及精密度（n=6）

接表3

2.7 样品分析

按上述检测方法，对6类共计131批保健食品进行检测，结果显示除促进消化类保健食品中未检出农药残留外，其他5类均有多种农药残留检出，检测结果见表4～表6。检测结果显示：131批次保健食品中有119批次有农药残留检出，检出率为90.8%，检出农药残留种类有9种，3-羟基克百威、吡蚜酮、硫线磷、灭多威、涕灭威砜、辛硫磷在6类保健食品中均未检出，甲氨基阿维菌素检出率最高，达到90.8%，其次为甲基硫菌灵，检出率为33.6%，其他农药残留检出率在0.8%～14.5%之间。结果表明试验方法方便、快速，灵敏度较好，可实现植物源保健食品中多种农药残留的检测。

表4 通便类、减肥类检测结果

表5 清咽类检测结果

表6 降血糖/降血压类、缓解体力疲劳/增强免疫类检测结果

3 结论

试验采用超高效液相色谱-串联质谱法，对通便类、减肥类、清咽类、缓解体力疲劳/增强免疫类、降血糖/降血压类、促进消化类共计6类131批次保健食品中的15种农药残留进行检测。具体过程：片剂经乙腈-乙酸提取、胶囊剂经乙腈提取、净化后经超高效液相色谱分离，串联质谱仪定性，外标法定量，通过方法验证，符合植物源保健品中的农药残留检测标准。从检测结果来看，植物源保健品中普遍存在农药残留情况，有119批次检出农药残留，检出率达90.8%。有64批次检出2种及以上的农药残留，其中：有3批次检出5种农药残留；有4批次检出4种农药残留；有17批次检出3种农药残留；40批次检出2种农药残留，降血糖、降血压类检出的农药残留种类最多。多菌灵（3.22 mg/kg）、甲基硫菌灵（0.624 mg/kg）、霜霉威（0.459 mg/kg）检出较高的残留量，其他含量较低。

该试验质谱扫描采用MRM扫描模式，回收率、精确度均良好，可显著提高灵敏度，实现多种物质同时测定，适合植物源保健品中农药残留的筛查和确证。该方法操作简单、检测速度快，适用于大批量样品检测，可为后续各类别植物源保健品农药残留的检测提供方法依据，为植物源保健食品的质量控制提供理论依据。