基于电子鼻探究不同发酵剂对凝固型酸羊乳的影响

刘亚文，刘珊珊，石艳，韩金莲，白丽娟*

1.锦州医科大学食品与健康学院 辽宁省肉类加工与质量安全控制专业技术创新中心（锦州 121000）；

2.锦州市检验检测认证中心（锦州 121000）；3.盘锦宋大房食品有限公司（盘锦 124000）

羊奶以其营养丰富、容易吸收等优点被视为乳品中的精品，被誉为“奶中之王”，同时也是世界上公认的最接近人乳的可开发乳品[1]。并且山羊奶还具有更好的消化率、低过敏性、更高的缓冲能力和更高的pH[2]。虽然鲜羊奶有多种优点，但其膻味导致不少消费者对鲜羊奶制品望而却步[3]。如果将羊奶经过发酵制成酸奶产品，不仅在一定程度上弱化了羊奶的膻味，更好地提升了羊奶的口感，同时更优化了鲜羊奶的营养价值[4]。苏伟丽等[5]通过设置不同的变量成功探究出生产低膻味酸羊奶的最佳工艺条件。陈合等[6]从牛奶发酵剂中筛选出适用于羊奶发酵的菌种，并完成对凝固型酸羊奶发酵工艺的优化。李莹等[7]通过响应曲面法对生产山羊酸奶的配方与发酵工艺进行了优化。张富新[8]通过大量试验证实了羊奶发酵成酸奶是可行的。山羊乳酸奶由于具有较高的营养成分和生物活性肽，可提供极好的健康价值[9]，山羊奶具有开发为功能性食品的潜力，特别是针对炎症性肠病和消化不良人群[10]。目前国际上羊奶产品研究开发较为广泛，而我国羊奶加工以奶粉及液态奶居多[11]。市场上对酸牛奶的推广较多，酸羊奶的开发还有很大空间，所以酸羊奶的研究开发具有重要意义，能更好地弥补羊奶市场的空缺，是一片值得推进的绿色发展新领域。电子鼻技术可以监测羊奶发酵前后不同阶段挥发性成分的变化，为进一步研究发酵羊奶能够降低羊奶膻味的机理奠定基础[12]。

该试验采用3种发酵剂（YO-MIX883、YOMIX300、YO-MIX900）分别发酵成以鲜羊乳为原料的凝固型酸羊乳，通过不同发酵剂添加量、加糖量、发酵温度与发酵时间的单因素试验及响应面设计来优化凝固型酸羊乳的工艺参数，并利用电子鼻对酸羊乳的风味稳定性进行检测，以期获得凝固型酸羊乳生产的最优发酵剂及工艺参数，用于工业生产，弥补市场空缺。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

羊奶（九羊纯羊奶）；白砂糖（市售，一级）；发酵剂（丹尼斯克菌种，型号YO-MIX883，YOMIX300和YO-MIX900）；氢氧化钠（济南盈动化工有限公司）；酚酞指示剂（国药集团化学试剂有限公司）；PEN3型电子鼻（德国AIRDENSE公司）；BCD-215KS冰箱（青岛海尔股份有限公司）；C21-Simple101美的电磁炉（美的集团有限公司）；SWCJ-1F型超净工作台（苏州安泰有限公司）；GHP-9270隔水式恒温培养箱（上海-恒科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 凝固型酸羊乳的制备

发酵剂的预处理：将3种发酵剂活化，并以4%的添加量分别接种到灭菌后的鲜羊乳中，在43±1 ℃恒温箱中培养3～4 h，置于4 ℃或5 ℃冰箱备用。

成品羊奶→加热（75±1 ℃）→配料混合（6%白砂糖）→杀菌（95 ℃，5 min）→冷却→接种发酵剂（4%）→灌装→发酵（43±1 ℃，3～4 h）→冷却→放入冰箱后发酵→成品

1.2.2 不同发酵条件对凝固型酸羊乳风味的影响

在单因素试验中，将制备的YO-MIX883、YOMIX300、YO-MIX900发酵剂分别以2%，3%，4%，5%和6%的接种量分别接种到加糖量为2%，4%，6%，8%和10%的杀菌过后的羊乳中，再分别放入39，41，43，45和47 ℃的隔水式恒温培养箱中发酵3.0，3.5，4.0，4.5和5.0 h。将上述各项单因素试验后形成的凝固型酸羊乳在4 ℃冰箱后熟，依次进行感官评定和酸度检测，探究不同发酵剂添加量、加糖量、发酵时间和温度对凝固型酸羊乳风味的影响。

1.2.3 响应面优化试验设计

根据单因素试验结果，设定发酵剂接种量、加糖量、发酵温度、发酵时间为4个因素，分别取3个水平，以酸羊乳的感官评分为响应值，通过响应面分析法对四因素三水平进行试验设计，响应面分析因素及水平见表1。

表1 响应面分析因素及水平表

1.2.4 酸羊乳的感官评价标准

邀请10名食品评审员对制得的酸羊乳进行品尝，对产品的风味、色泽、口感和组织状态4个方面进行评价计分。

表2 酸羊奶感官评分标准

1.2.5 电子鼻的检测

分别量取10 mL发酵后在4 ℃冰箱存放1，4，7，10和13 d的样品置于30 mL样品瓶中，用封口膜封口，在温度30 ℃条件下静置5 min后直接将进样针头插入样品瓶，采用顶空吸气法进行电子鼻分析试验。电子鼻测定参数：清洗时间120 s、归零时间5 s、预进样时间5 s、测定时间60 s[13-14]、载气流速300 mL/min。每个样品测定3次。电子鼻各传感器信息见表3。

表3 电子鼻传感器所对应的气味类型

1.2.6 凝固型羊奶酸奶酸度的测定

羊奶酸奶酸度的测定按 GB 5409—85方法[15]，酸度用吉尔涅尔度（°T）表示。

1.3 统计学方法

应用SPSS 17.0进行统计分析，定量资料应用均数±标准差表示，先行方差齐性检验，依条件行t检验、方差分析等，以P＜0.05为差异显著，有统计学意义，绘图采用Excel 2010。主成分分析法（Principal Component Analysis，PCA）、线性判别分析法（Linear Discriminant Analysis，LDA）[16]，用Winmuster软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 不同发酵条件对凝固型酸羊乳品质的影响

2.1.1 不同发酵剂接种量对凝固型酸羊乳风味的影响

将3种发酵剂分别以2%，3%，4%，5%和6%的接种量接种到加糖量为6%的杀菌过后的羊乳中，在43℃的隔水式恒温培养箱中发酵4 h，发酵至凝固后进行感官评定，随后进行滴定酸度的测定，重复3次试验。感观评分及酸度变化如图1所示。

图1 不同发酵剂接种量对凝固型酸羊乳感官及酸度的影响

从图1可知：YO-MIX883、YO-MIX300、YOMIX900三种型号的发酵剂均在接种量为4%时感官评分可达到较高分，MIX900最高达90分，发酵后的凝固型酸羊乳的风味醇正、组织结构细腻。在发酵剂过少的情况下酸甜比上会造成失衡，导致口感方面不被大众所接受；在发酵剂过多的情况下会造成组织状态方面的问题，例如乳清析出的状况。并且从图中柱状图中可以看出酸度随着接种量的增大而增高，这可能是因为发酵剂接种量加大导致乳酸菌增多，在接种量4%时酸度84°T为酸奶的最宜酸度。综上所述选用MIX900发酵剂、接种量为4%时最为适宜，并且试验中发现可以通过菌种的发酵可消除羊乳中固有的膻味。从全图中可以看到三种发酵剂对产品的影响依次为YO-MIX900＞YO-MIX300＞YO-MIX883。

2.1.2 不同加糖量对凝固型酸羊乳风味的影响

将3种发酵剂分别以4%的接种量接种于加糖量分别为2%，4%，6%，8%和10%的杀菌过后的羊乳中，在43 ℃的隔水式恒温培养箱中发酵4 h，发酵至凝固后进行感官评定，随后进行滴定酸度的测定，重复3次试验。感观评分及酸度变化如图2所示。

从图2可知，感官评分分数变化呈先上升后下降的趋势，在加糖量大于6%时酸度得到了明显降低，但凝固时间延长，这可能是因为糖影响了菌种的生长繁殖。因此加糖量为6%时凝固型酸羊乳的口感及风味最佳，酸甜比例适宜。并且从全图中可以看到三种发酵剂对产品的影响依次为YO-MIX900＞YOMIX300＞YO-MIX883。

2.1.3 不同发酵温度对凝固型酸羊乳风味的影响

将3种发酵剂分别以4%的量接种量，6%加糖量，依次在39，41，43，45和47 ℃的隔水式恒温培养箱发酵4 h至凝固进行感官评分，随后进行滴定酸度的测定，重复3次试验。感观评分及酸度变化如图3所示。

从图3可知，随着发酵温度的升高感官评分也随之升高，整体呈先上升后下降的趋势，这是因为发酵温度可以直接影响酸羊乳发酵产品的品质，在发酵温度过低时会造成凝乳状态不佳，乳清析出，组织状态粗糙的问题。当发酵温度过低时也会造成乳清析出的问题，并且从上述柱形图中可以看出酸度值随着温度的上升而上升，这是由于在高温条件下乳酸会增多的原因，从而也是导致酸甜比失衡，感官评分降低的重要原因。图中显示43 ℃时感官评分最高，因此选用发酵温度43 ℃对于凝固型酸羊乳发酵较为适宜，并且从全图中可以看到三种发酵剂对产品的影响依次为YOMIX900＞YO-MIX300＞YO-MIX883。

2.1.4 不同发酵时间对凝固型酸羊乳风味的影响

将3种发酵剂分别以4%的接种量，6%加糖量，在43 ℃的隔水式恒温培养箱发酵的条件下，依次在3.0，3.5，4.0，4.5和5.0 h发酵时间下进行感官评分，随后进行滴定酸度的测定，重复3次试验。感观评分及酸度变化如图4所示。

图4 不同发酵时间、不同发酵剂对样品感官及酸度的影响

发酵时间对产品整体品质有着极大的影响，时间过长或过短都会造成产品风味的改变。从图4可知，在发酵时间为4 h时感官评分达到最高值，因此选用发酵时间4 h进凝固型酸羊乳的制备，且从全图中可以看到三种发酵剂对产品的影响依次为YO-MIX900＞YOMIX300＞YO-MIX883。

通过上述分析结果发现，3种发酵剂中YO-MIX900更为突出，相应的感官评分也优于YO-MIX300和YOMIX883，并且酸奶的标准酸度处于82～85 °T左右，所以发酵剂YO-MIX900为最适发酵剂，此条件下凝固型酸羊乳酸甜适口，口感细腻无颗粒，组织表面光滑。因此后续响应面优化试验选用发酵剂YO-MIX900进行发酵并对其做出分析。

2.2 响应面优化凝固型酸羊乳试验结果与分析

为确定凝固型酸羊乳的工艺参数，以发酵剂YOMIX900的接种量（A）、加糖量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）为试验因素，利用Box-Behnken中心组合试验设计，主要以感官评分为响应值（Y）。分析方案及结果如表4所示：

根据表4响应面分析结果，用软件Design-Expert 8.0.6进行分析，得出结果，感官得分与各项因素的二次方程模型：Y=95.40+0.33×A+1.00×B+0.083×C-1.58×D-0.75×A×B-2.00×A×C+1.25×A×D-1.00×B×C+0.75×B×D+0.25×C×D-7.62×A2-7.62×B2-7.99×C2-6.24×D2。

表4 响应面分析方案及结果

根据表5可知，整体模型的P＜0.01，表明该模型显著水平到达最优，并且其中的失拟项不显著，并且R-Squared值为0.982 3，AdjR-Squared值0.964 6，都接近值1，Adeq Precision的值22.238大于4，说明该模型合理，可以看出各项因素与响应值之间的有较高的真实性。由F值可知，4个因素对凝固型酸羊乳品质的影响最大的是发酵时间，接下来依次的顺序为加糖量、发酵剂接种量，最后是发酵温度。

表5 回归方程方差分析

根据回归方程的分析，做出相应的3D曲面图和等线图，考察4个因素两两进行交互所拟合出的曲面图形状，进而分析对凝固型酸羊乳感官得分的影响。

图7 发酵剂接种量与发酵时间对凝固型酸羊乳感官评分影响的响应曲面图及等高线

图8 加糖量与发酵温度对凝固型酸羊乳感官评分影响的响应曲面图及等高线

图9 加糖量与发酵时间对凝固型酸羊乳感官评分影响的响应曲面图及等高线

响应面的坡度决定了两两因素交互作用对产品感官的显著与否，坡度与显著性呈正向相关，坡度越陡峭越显著。等高线图表示两个因素之间的交互作用，呈椭圆时表示交互作用很大。试验结果均符合以上特点。图5～图10表明：当发酵剂接种量、加糖量、发酵温度和发酵时间的逐渐增加时，感官评分均呈先升高后下降的趋势，并且可以看出因素发酵时间对凝固型酸羊乳的影响最大。结合响应面分析结果可知，最佳工艺参数为发酵剂接种量4%、加糖量6%、发酵温度43 ℃、发酵时间4 h。对此条件下发酵出的凝固型酸羊乳进行感官评定，经过专业感官评价人员给分，重复3次，感官评价平均分数可以达到95分，相比较其他试验组合评分位于前列。并且该条件下制成凝固型酸羊乳的成品经过品尝之后受大众喜欢。说明响应面优化后方案的可行性，但考虑后期的实际生产，为此进行验证试验，根据响应面优化试验结果得出的最佳工艺参数进行试验，重复3次做平行试验，经过感官评定小组评定，重复3次的平均分数可以达到95分，与响应面软件给出的预测值95.528相对偏差小于1%，表明该试验的响应面优化试验合理。

图5 发酵剂接种量与加糖量对凝固型酸羊乳感官评分影响的响应曲面图及等高线

图10 发酵温度与发酵时间对凝固型酸羊乳感官评分影响的响应曲面图及等高线

2.3 利用电子鼻监测酸羊乳风味的变化

2.3.1 酸羊乳在保存中PCA主成分分析

在发酵剂YO-MIX900接种量4%，加糖量6%，发酵温度43 ℃，发酵时间4 h条件下，将发酵好的酸羊乳，于4 ℃冷藏贮存13 d，分别在1，4，7，10和13 d利用电子鼻进行测定。图中每个椭圆代表羊乳发酵不同时间的数据采集点。

图11是YO-MIX900发酵剂制得的酸羊乳在4 ℃贮藏1～13 d过程中挥发性成分的PCA主成分分析图。由图11可知：第一主成分区分贡献率为93.38%，第二主成分区分贡献率为4.49%，两个主成分贡献率的和为97.87%，大于85%，所以这两个主成分已经很好代表了样品的主要信息特征。从图11主成分PC1和PC2两个主轴上来看，第1，第7和第13天的样本比较近，第4天与第10天样本较远，各个样本能够明显区分。说明电子鼻能较好区分贮存第1～第13天YO-MIX900发酵剂发酵的样本酸羊乳，但是整体风味相差不大，说明产品贮存期间比较稳定。

图11 YO-MIX900发酵剂酸羊乳5 ℃保存1～13 d PCA主成分贡献率

2.3.2 酸羊乳在保存中LDA线性判别分析

图12是YO-MIX900发酵剂制得的酸羊乳在4 ℃贮藏1～13 d过程中挥发性成分的LDA主成分分析图。由图12可知：第一主成分区分贡献率为79.09%，第二主成分区分贡献率为11.79%，两个主成分贡献率的和为90.88%，大于85%。从图12可知：第4，第7和第10天风味差异明显，第1和第13天样本相近，说明YOMIX900发酵剂发酵的酸羊乳在保藏过程中挥发性成分（硫化氢、有机芳香硫化物和氮氧化合物为主）变化差别不是很大，因此风味虽有变化但不是特别明显，即在保质期内无明显变化，与风味变化不显著的理论相吻合。综上分析发现YO-MIX900发酵的酸羊奶在保存期内风味变化不显著，气味比较稳定，是比较理想的发酵剂。

图12 YO-MIX900发酵剂酸羊乳5 ℃保存1～13 d LDA分析

3 结论

通过使用YO-MIX883、YO-MIX300、YOMIX900发酵剂，在不同发酵条件下发酵制得酸羊乳，经响应面优化试验后并对酸羊乳在感官特性、贮存中风味变化以及发酵后酸羊乳酸度检测，结果发现：发酵剂YO-MIX900在接种量4%、加糖量6%、发酵温度43 ℃、发酵时间4 h获得的酸羊乳风味稳定、酸味适中，且利用电子鼻对酸羊乳风味进行检测，挥发性物质变化小，检测结果较优，感官评定结果较佳，因此YO-MIX900是凝固型酸羊乳较理想的发酵剂，可用于工业生产。当前我国各地区出台了各项奶业振兴计划，而羊奶是最适宜我国国民饮用的乳品，并且加工技术逐渐成熟，大有增长的势头，所以羊奶产业拥有光明的前景，相信将来羊奶开发产品可迎来空前的发展前景。