响应面法优化提取百香果皮花色苷类色素及其稳定性研究

王鑫蒙，艾春辛，赵文静，石彬，张伟*，郭娇*

1.新乡学院化学与材料工程学院（新乡 453003）；2.新乡市博源科技有限公司（新乡 453003）

百香果果皮中含有花色苷类成分[1]，花色苷类色素在自然界中分布较为广泛，是没有毒性且资源较为丰富的天然色素，它可以保护心血管、抗氧化、抗肿瘤，且具有清除自由基、调节免疫功能等生理功能[2-3]。

国内外研究报道花色苷类物质的提取方法有超临界流体萃取法[4]、超声波辅助提取法[5]、酶法[6]、高压脉冲电场[7]、微波萃取法[8]。这些方法较为复杂、对设备要求较高，而溶剂萃取法[9]比较温和，对花色苷类色素的破坏性小。溶剂萃取法对百香果皮中的花色苷类色素提取的相关研究尚未见诸报道，试验采用响应面法优化溶剂萃取提取花色苷类色素的条件并对其稳定性进行研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

紫皮百香果（广西壮族自治区，网购）；无水乙醇、过氧化氢、亚硫酸钠、盐酸、蔗糖（均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；定性滤纸（杭州特种纸业有限公司）。

1.2 试验仪器与设备

UV-1600紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；电子天平（梅特勒托利多）；标准筛（绍兴市上虞区豪泉筛具厂）；DHG-9246A电热恒温鼓风干燥箱（广州番禺旭东阪田电子有限公司）；pH计（梅特勒-托利多公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 花色苷类色素的提取

将购买的紫皮百香果洗净去除内表皮后放烘箱内，温度40 ℃烘干12 h取出打碎过0.25 mm标准筛备用；准确称取1.00 g原料于比色管中，以盐酸酸化的60%乙醇为提取剂，在温度50 ℃、料液比1∶30（g/mL）的条件下水浴浸提2 h后用抽滤装置进行处理；取1 mL滤液用缓冲液定容到10 mL，静置2 h后，在510 nm处测定花色苷类溶液的吸光度，并将其结果带入式（1）[10]计算溶液花色苷含量（mg/L），通过式（2）[10]计算花色苷提取率（mg/g）[11-12]。

式中：A为510 nm处吸光度；MW为花色苷相对分子质量，465；DF为稀释倍数；ε为摩尔消光系数，35 481；l为比色皿光程（1 cm）。

式中：c为溶液中花色苷质量浓度，mg/mL；V为溶液体积，mL；m为原料质量，g。

1.3.2 花色苷类色素稳定性的分析

将单因素试验获得的滤液用来做稳定性分析。

1.3.2.1 光照稳定性分析

分别取适量的滤液于透明和棕色容量瓶中，透明容量瓶放置光照处，棕色容量瓶放置暗处，连续7 d取1 mL 2种光照条件下的滤液，用缓冲液定容到10 mL，静置2 h测吸光度。

1.3.2.2 蔗糖浓度稳定性分析

分别称取0，0.1，0.2，1.0，1.5，2.0和2.5 g的蔗糖于10 mL的蒸馏水中配制成不同浓度的蔗糖溶液定容滤液，空白样用蒸馏水定容，静置2 h测定吸光度。

1.3.2.3 氧化剂稳定性分析

用蒸馏水将H2O2配制成1%，2%，3%，6%和15%的溶液定容滤液，空白样用蒸馏水定容，静置2 h测定吸光度。

1.3.2.4 还原剂稳定性分析

用蒸馏水将Na2SO3配制成10，20，30，40和60 g/L的溶液定容酸性花色苷类溶液，空白样用蒸馏水定容，静置2 h测定吸光度。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验花色苷类色素提取工艺的优化

2.1.1 提取时间对花色苷类色素提取效果的影响

如图1所示：花色苷类色素提取率在提取时间1 h处达到最大，超过1 h之后提取率逐渐下降；同时提取时间加长，花色苷类色素会受热分解，使生产周期变长，能耗增加，生产成本变高，所以最佳提取时间为1 h。

2.1.2 提取温度对花色苷类色素提取效果的影响

如图2所示：温度升高时，提取液含有的花色苷类色素含量先升高后降低；温度上升到30 ℃，花色苷类色素的提取率最高；温度继续升高时，花色苷类色素的提取率下降。这可能与花色苷类色素受热分解有关，因此最佳提取温度为30 ℃。

图2 不同提取温度下花色苷类色素的提取率

2.1.3 pH对花色苷类色素提取效果的影响

如图3所示，pH提高时，花色苷类色素的提取率在pH 3时达到最大，之后呈现降低趋势，又因为花色苷类色素在中性和弱碱条件下不稳定[11]，所以最佳pH为3。

图3 不同pH下花色苷类色素的提取率

2.1.4 料液比对花色苷类色素提取效果的影响

如图4所示，料液比逐渐减小时，花色苷溶液的吸光度也变得越小，选择料液比1∶20（g/mL）最佳。

图4 不同料液比下花色苷类色素的提取率

2.1.5 原料粉碎粒度对花色苷类色素提取效果的影响如图5所示：粒度从0.18 mm到0.83 mm的过程中，花色苷类色素含量的提取率缓慢下降；由于每2点间的斜率在逐渐减缓，且0.18 mm对设备要求偏高，也会增大物料、能源的消耗。所以选择过筛的物料粒度0.25 mm最佳。

图5 不同粒度下花色苷类色素的提取率

2.1.6 乙醇体积分数对花色苷类色素提取效果的影响

如图6所示，乙醇体积分数对溶液中花色苷类色素含量的影响曲线高低起伏，60%时花色苷类色素提取率达到最大。因此选择乙醇体积分数60%最佳。

图6 不同乙醇体积分数下花色苷类色素的提取率

2.2 花色苷类色素提取工艺优化Box-Behnken试验结果与分析

2.2.1 模型的建立及显著性检验

在单因素试验基础上，以花色苷类色素的提取率（Y）为响应值，以花色苷类色素提取率有显著影响的提取时间（X1）、提取温度（X2）、乙醇体积分数（X3）和提取液pH（X4）为考察因素，对提取花色苷类色素的最佳工艺进行响应面分析，Box-Behnken试验因素[13]与水平见表1，试验结果与分析见表2。对回归方程进行方差分析，结果见表3。

表1 花色苷类色素提取工艺条件优化Box-Behnken试验因素与水平

表2 花色苷类色素提取工艺条件优化Box-Behnken试验结果与分析

如表3所示，模型概率值P＜0.000 1显著，失拟项P＞0.05不显著，说明所建立的模型极显著，可以较好地拟合花色苷类色素的提取条件。通过方差分析，由P值可知各因素影响强弱次序：提取时间＞提取温度＞提取剂pH＞乙醇体积分数。提取时间、提取温度对结果有极显著影响（P＜0.01），提取剂pH有显著影响（P＜0.05）。

表3 响应面试验结果方差分析

2.2.2 百香果外果皮花色苷类色素响应面分析

四因素交互作用对花色苷类色素提取率影响的响应面曲线及等高线见图7～图9。

图7 时间与温度、乙醇体积分数交互作用对花色苷类色素提取率影响的响应面和等高线

图8 pH与乙醇体积分数、时间交互作用对花色苷类色素提取率影响的响应面和等高线

图9 温度与pH、乙醇体积分数交互作用对花色苷类色素提取率影响的响应面和等高线

结果表明：固定提取时间，当乙醇体积分数、提取剂pH增大时，溶液中花色苷类色素含量呈现先增加后降低趋势；提取时间、乙醇体积分数两因素交互影响的等高线未闭合但是响应面呈凸形，说明二项式提取时间影响大；提取时间、提取剂pH两因素交互影响的等高线未闭合但是响应面呈凸形，说明二项式提取剂pH影响大；分析结果和表3中的显著性一致。

利用Design-Expert 11软件对所得的回归方程进行回归分析，确定最佳工艺参数时间1.555 h、提取温度55.281 ℃、乙醇体积分数65.186%、提取剂pH 2.424，此时花色苷类色素提取率预测值为3.508 mg/g。为了方便实际操作，将最佳工艺参数修改为提取时间1.5 h、提取温度55 ℃、乙醇体积分数65%、提取剂pH 2.4，在此最优条件下，花色苷类色素的提取率为3.520 mg/g，与模型预测值3.508 mg/g较一致，验证模型的可靠性。

2.3 花色苷类色素的稳定性分析

2.3.1 光照对花色苷类色素稳定性的影响

如图10所示，60%乙醇提取出来的花色苷类溶液在避光条件下吸光度高于光照条件下的溶液吸光度。吸光度越高，说明色素残存越多，色素越稳定。因此，避光条件有利于色素的保存。

图10 光照对花色苷类色素稳定性的影响

2.3.2 蔗糖浓度对花色苷类色素稳定性的影响

如图11所示，整体对比空白样可知，在同一波长下，蔗糖浓度越高，溶液吸光度越高，说明色素残存越多，色素越稳定。因此，蔗糖浓度对花色苷类色素的稳定性有影响，蔗糖浓度越高，对花色苷类色素保护作用越强。

图11 蔗糖浓度对花色苷类色素稳定性的影响

2.3.3 氧化剂对花色苷类色素稳定性的影响

如图12所示，在同一波长下，氧化剂浓度越大，花色苷类溶液的吸光度越低，说明色素残存越少，色素越不稳定。因此，氧化剂对花色苷类色素的稳定性有显著影响，花色苷类色素抗氧化性能较差。

图12 氧化剂对花色苷类色素稳定性的影响

2.3.4 还原剂对花色苷类色素稳定性的影响

如图13所示，整体对比空白样可知，在同一波长下还原剂浓度越高，花色苷类溶液的吸光度越高，说明色素残存越多，色素越稳定。因此，还原剂对Na2SO3具有一定的保护作用，花色苷类色素的耐还原性较好。

图13 还原剂对花色苷类色素稳定性的影响

3 结论

以百香果为原料，以花色苷类色素提取率为响应值，通过单因素试验和响应曲面法确定花色苷类色素提取的最佳工艺参数：百香果皮干燥的粒度0.25 mm过筛、提取时间1.5 h、提取温度55 ℃、乙醇体积分数65%、pH 2.4、液料比1∶20（g/mL）。在此最优条件下，花色苷类色素的提取率为3.520 mg/g，与模型预测值较一致。

同时，试验对花色苷类色素的稳定性进行研究分析，结果表明避光、蔗糖浓度越高、氧化剂浓度越小、还原剂浓度越大，越有利于花色苷类色素稳定。试验结果为花色苷类色素的实际生产和储存条件提供理论依据。