海参肽酸奶工艺优化及抗氧化性研究

肖彦春，田晓玲，郝长红，刘巍巍，庞然

辽宁农业职业技术学院食品药品学院（营口 115009）

海参素有“海中人参”之称，其作为高效营养滋补品已被熟知。海参肽是以鲜活海参为原料，经蛋白酶水解，分离纯化后得到以小分子肽为主，多种功效成分共存的蛋白质水解产物[1]。其具有良好的溶解性、稳定性，低黏度，易消化吸收，生物效价高，无抗原性，食用安全，降血压，预防心脑血管疾病，抗疲劳，增强体力，提高免疫力，抗肿瘤，抗氧化，延缓衰老等特点[2-4]。市场上有将海参肽添加到日常食品中，如海参肽糖果、海参肽酒、海参肽酵素、海参肽固体饮料等产品[5-6]，将海参这种传统酒席宴上的佳肴珍品制作成日常生活中营养价值更高、食用更方便的高级优质食品。而将海参肽应用到发酵乳产品中，在国内报道较少。因此，此文以保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌作为发酵剂，通过单因素试验和正交试验探究海参肽酸奶的最佳工艺配方，并对其抗氧化性进行评价，旨在丰富酸奶产品类型，为海参肽开发利用提供一定技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种及其他添加材料

乳酸菌种YO-MIX 900 LYO 50 DCU[嗜热链球菌、保加利亚亚种，丹尼斯克（中国）有限公司]；海参肽（湖北瑞邦生物科技有限公司）；蔗糖（广西糖业集团西江制糖有限公司）。

1.1.2 试剂

氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司）；铁氰化钾（分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司）；三氯乙酸、三氯化铁（分析纯，茂名市雄大化工有限公司）；DPPH（含量≥97.0%，福州飞净生物科技）。

1.1.3 仪器与设备

电子天平（JY20002，上海舜宇恒平）；恒温培养箱（ZHP-250，上海三发）；高压均质机（GJJ-0.06/70，上海诺尼）；冰箱（BCD-236WDGL，海尔）；高压蒸汽灭菌锅（BKQP-12，山东博科）；离心机（h1850，湘仪）；分光光度计（752，舜宇恒平）。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程鲜乳、蔗糖、海参肽等→混匀调制→均质→杀菌→冷却→接菌种→灌装→发酵→冷藏→成品

1.2.2 操作方法

1.2.2.1 调制

选择新鲜鲜奶，总干物质含量不得低于11.5%，其中非脂干物质不得少于8.5%，否则会影响蛋白质的凝乳作用。蔗糖、海参肽等混合后加水加热溶解充分后添加到鲜奶中混匀调制。

1.2.2.2 均质

将牛乳升温加热至50～60 ℃，加入至均质机中，8～10 MPa压力下均质。均质可防止脂肪上浮，使脂肪微粒化，改善口感。

1.2.2.3 杀菌

将均质后的混合乳液于90～95 ℃杀菌15 min。或采用高温瞬时杀菌，在135～140 ℃加热2 s，有利于营养成分的保存。

1.2.2.4 冷却、接种、灌装、发酵

将杀菌后的混合乳冷却到40～45 ℃，无菌条件下接种发酵剂，混合均匀，灌装、贴上标签，温度在40～43 ℃下培养6～7 h。

1.2.2.5 冷藏后熟

达到发酵时间后，立即放入冰箱，进行钝化24 h，取出。

1.2.3 单因素试验设计

1.2.3.1 蔗糖添加量的选择

在菌粉添加量12 mg/L、海参肽添加量2 g/L、发酵时间6 h条件下，蔗糖添加量设定为0，20，40，60和80 g/L，研究蔗糖添加量对酸奶感官的影响。

1.2.3.2 海参肽添加量的选择

在蔗糖添加量60 g/L、菌粉添加量12 mg/L，发酵时间6 h条件下，海参肽的添加量设定为0，1.2，2.0，2.8和4.0 g/L，研究海参肽添加量对酸奶感官的影响。

1.2.3.3 菌粉添加量的选择

在蔗糖添加量60 g/L、海参肽添加量2 g/L、发酵时间6 h条件下，菌粉添加量设定为4，8，12，16和20 mg/L，研究菌粉添加量对酸奶感官的影响。

1.2.3.4 发酵时间的选择

在蔗糖添加量60 g/L、菌粉添加量12 mg/L、海参肽添加量2 g/L条件下，发酵时间设定为4，5，6，7，8和9 h，研究发酵时间对酸奶感官的影响。

1.2.4 正交试验

基于单因素试验结果，以感官评价为考察指标，采用四因素三水平L9(34)正交试验设计。研究蔗糖添加量（A）、菌粉添加量（B）、海参肽添加量（C）、发酵时间（D）对酸奶感官品质的影响，以确定最佳海参肽酸奶工艺。正交试验因素与水平如表1所示。

表1 正交试验因素与水平

1.3 指标测定

1.3.1 感官评定

随机选择有经验品评者15人组成评定小组，按照感官评分标准表（表2）评价。取10 mL乳样放在20 mL样品杯中，观察乳样的色泽和组织状态，闻其气味，最后口中含乳样，品尝滋味。感官评定综合评分为100分，结果取15人各自评分总分的平均值。

表2 感官评分标准

1.3.2 理化和微生物指标测定

根据GB 19302—2010《食品安全国家标准 发酵乳》中的指标要求，对酸奶的蛋白质、脂肪、酸度、乳酸菌数、大肠杆菌、致病菌等分别进行测定。

1.3.3 海参肽酸奶的抗氧化活性评定

1.3.3.1 还原力测定

取1.0 mL待测样于10 mL试管中，先后向其中加入2.5 mL pH 6.6磷酸盐缓冲液，2.5 mL 1%铁氰化钾溶液，混匀，50 ℃水浴反应25 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸，混匀，3 000 r/min离心5 min。取上清液2.5 mL，加蒸馏水2.5 mL，加0.5 mL 1%三氯化铁，摇匀静置10 min，在波长700 nm处进行比色测定吸光度[7]。

1.3.3.2 DPPH自由基清除率测定

取8 mL 1.0×10-4mol/L DPPH-乙醇溶液与2 mL样品或95%乙醇（空白对照）混合、振荡，室温暗处放置30 min，3 000 r/min离心10 min，取上清液于波长517 nm处测吸光度[8]。DPPH清除率用式（1）计算。

式中：A0为空白吸光度；A1为样品吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 蔗糖添加量对海参肽酸奶感官品质的影响

从表3中可以看出，蔗糖添加量0～60 g/L时，海参肽酸奶的感官评分逐渐增加。蔗糖含量低时，酸奶甜度不足，酸度过高，风味较差，感官评分较低；随蔗糖添加量增加，甜度逐渐增高，蔗糖添加量60 g/L时，酸奶口感光滑细腻，组织状态良好，酸甜适中，感官评分最高88.0分；随着蔗糖添加量继续增加，酸奶口味偏甜，感官评分降低，因此最佳的蔗糖添加量为60 g/L。

2.1.2 海参肽添加量对海参肽酸奶感官品质的影响

从表4可以看出，海参肽添加量0～2 g/L时，酸奶的感官评分逐渐增加，组织状态逐渐细腻。海参肽添加量2 g/L时，黏度适中，无乳清析出，入口细腻爽滑，酸甜适中，无异味，感官评分达到最高86.7分；随着海参肽添加量的继续增加，感官评分逐渐下降，海参肽添加量4 g/L时，酸乳的气味、口感都明显降低，因此海参肽的最佳添加量为2 g/L。

表4 海参肽添加量对海参肽酸奶感官品质的影响

2.1.3 菌种添加量对海参肽酸奶感官品质的影响

从表5中可以看出，菌粉添加量较少时，酸奶组织状态粗糙，有乳清析出，有颗粒，风味不明显；随菌种添加量的增加，口感逐渐提高，菌种添加量达到12 mg/L时，酸奶口感光滑细腻，组织状态良好，酸甜适中，感官评分最高87.4分；随着菌种添加量的增加，酸奶酸度增大，口感过酸，且有微量乳清析出。因此，最佳菌种添加量为12 mg/L。

2.1.4 发酵时间对感官评分的影响

从表6中可以看出，发酵时间4～7 h时，随着发酵时间的增加，酸奶的组织状态、口感等逐渐变好。发酵7 h时，风味浓郁、组织均匀细腻，口感圆润，感官评分达到最高值86.7分。随着发酵时间的继续延长，酸奶味道偏酸，感官评分逐渐降低。因此最佳发酵时间为7 h。

表6 发酵时间对海参肽酸奶感官品种的影响

2.2 正交试验结果

在单因素试验基础上，以感官评分为指标，对海参肽添加量、蔗糖添加量、菌种添加量、发酵时间4个因素进行四因素三水平正交试验（表1）。正交试验安排和结果见表7，极差分析可以判断出各因素对感官品质影响的顺序为B＞C＞D＞A，即菌种添加量对海参肽酸奶感官品质影响最大，其次是海参肽粉添加量、发酵时间、蔗糖添加量。根据k值最佳组合A2B3C2D3和由正交表中直接对比分析的最优组合A2B1C2D3进行验证试验，结果见表8，可以看出组合A2B3C2D3的感官评分为87.8分，高于组合A2B1C2D3。因此海参肽酸奶的最佳配方为海参肽添加量2 g/L、蔗糖60 g/L、菌种接种量16 mg/L、发酵时间7 h。

表7 正交试验和结果分析

表8 最优试验组合验证

2.3 海参肽酸奶理化和微生物检测结果

海参肽酸奶呈乳白色，组织均匀、无气泡、无乳清析出，口感细腻爽滑、酸甜适中，有发酵乳固有香味。海参肽酸奶理化和微生物指标检测结果见表9，大肠杆菌、致病菌都未检出，均符合GB 19302—2010《食品安全国家标准 发酵乳》。

表9 海参肽酸奶理化及微生物检测结果

2.4 优化后海参肽酸奶抗氧化活性

2.4.1 还原力测定

有研究表明，不同分子量海参肽都具有显著的还原能力[9]，因此对优化后海参肽酸奶及对照酸奶进行还原力比较，测定的样品吸光度越大表明还原力越强。由图1可见，对照酸奶和海参肽酸奶的吸光度均随着样品浓度的增加而增大，并且海参肽酸奶的吸光度明显高于对照酸奶，质量浓度为50 mg/mL时，海参肽酸奶吸光度可达0.632。

图1 酸奶的还原力

2.4.2 DPPH自由基清除率

比较海参肽酸奶和未添加海参肽的对照酸奶对DPPH自由基的清除率，结果如图2所示。在相同酸奶浓度时，海参肽酸奶对DPPH自由基的清除能力远高于对照酸奶，并随着酸奶浓度的增加，DPPH自由基的清除率逐渐增强，质量浓度50 mg/mL时，海参肽酸奶对DPPH的清除率达58.6%。对海参肽的研究中发现其抗氧化性高于天然抗氧剂维生素C，具有较好清除自由基的作用[10]。有研究发现发酵乳中乳酸菌具有清除自由基的能力[11]，并且有报道酸奶中组氨酸、酪氨酸、赖氨酸等游离氨基酸具有抗氧化性[12]。通过海参肽的添加，进一步增强酸奶的抗氧化性，提高酸奶的附加值。

图2 DPPH自由基清除率

3 结论

试验以鲜牛奶、海参肽粉为原料，以保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌为菌种，在单因素试验的基础上，通过正交试验对海参肽酸奶进行进一步优化，确定海参肽酸奶最佳配方：海参肽添加量2 g/L、蔗糖60 g/L、菌种接种量16 mg/L、发酵时间7 h。该配方下酸奶组织均匀，口感细腻爽滑、酸甜适中，感官评分最高为87.8分，其理化指标和微生物指标都符合GB 19302—2010《食品安全国家标准 发酵乳》。海参肽酸奶的还原力及DPPH自由基清除率均高于对照酸奶，说明海参肽酸奶有效提高酸奶的抗氧化能力，提高产品的保健功能，为丰富酸奶产品类型、为海参肽开发利用提供新思路。