正交试验优化齿瓣石斛多糖提取工艺

刘洪均，包誉，胡江苗，何桃斌*，杨青松*

1.云南民族大学民族药资源化学国家民族事务委员会-教育部重点实验室（昆明 650504）；2.云南民族大学民族医药学院（昆明 650504）；3.中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室（昆明 650201）

石斛属（Dendrobium）是兰科（Orchidaceae）植物中第一大属，全球有约1 500种，广泛分布在亚洲、欧洲、大洋洲等地区[1]。在我国，已报道的石斛属植物超过80种[2]。石斛为名贵中药材，始载于《神农本草经》，主治热病伤津、胃痛干呕、肺燥干咳等症[3]。药理研究表明其具有抗衰老[4]、抗肿瘤[5]、免疫调节[6]、扩张血管[7]、降低血糖[8]等多种活性。齿瓣石斛（DendrobiumdevonianumPaxt），又称紫皮石斛、紫皮兰、水打棒、黄草等，在我国主要分布于云南、广西、贵州、西藏南部等地，具有滋阴益胃、生津止渴之功效[9-10]。云南省保山市龙陵县是齿瓣石斛传统分布区，也是齿瓣石斛主要种植区，初步统计全县种植齿瓣石斛3万余亩（1亩≈666.67 m2），有着“紫皮石斛之乡”的美誉。《云南省食品安全地方标准-紫皮石斛》发布，并于2018年2月19日正式实施。自此，齿瓣石斛除了传统加工枫斗之外，还可以作为地方特色食品。

齿瓣石斛多糖含量高，平均在30%左右[11]，特色食品加工过程中，为满足不同产品需求，对多糖得率、黏度、透明度等有不同要求。为探讨合理的齿瓣石斛多糖的提取方法，提升齿瓣石斛加工工艺，选取云南产齿瓣石斛为原料，通过设计正交试验，测定其多糖的提取率，找到较为优化的多糖提取工艺，为日后对齿瓣石斛的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

齿瓣石斛（云南省龙陵县龙陵石斛研究所）；葡萄糖（XK13-201-00115，天津市风船化学试剂科技有限公司）；蒽酮（Solarbio）；硫酸（四川西陇化工有限公司），均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LGJ-1冷冻干燥机（北京亚泰科隆仪器有限公司）；SK-18TC超声波清洗器（上海科仪）；DL-6M离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；FST-111-80超纯水机（上海富待特仪器设备有限公司）；DK-8AD电热恒温水浴槽（上海一恒科技有限公司）；-80 ℃超低温冰箱（中国海尔集团）；FDV超微粉碎机（北京环亚天元机械技术有限公司）；SI-114电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；移液器（大龙仪器）；多功能酶标仪（美国Molecular Devices Flexstation 3）。

1.3 试验方法

1.3.1 试验材料预处理

试验材料所用的齿瓣石斛采自云南龙陵。摘取当年生新鲜齿瓣石斛，洗净后去叶，只留其茎，放入干燥箱中烘干，取干燥的石斛样品，放入超微粉碎机中粉碎待用。

1.3.2 葡萄糖标准曲线的制备

分别取0.05，0.20，0.30，0.40，0.60，0.80和1.00 mL的0.1 g/L葡萄糖溶液于标记好的小离心管中，用蒸馏水补到1.0 mL，此为标准样品。分别加入4.00 mL蒽酮试剂，迅速放到冰水浴中冷却，各管加完后一起放入沸水浴中，在沸水中沸水浴10 min（自水沸起记时），而后用自来水冷却。室温放置10 min左右。另以1.0 mL蒸馏水同上平行操作，用移液枪分别移200 μL到全透明微孔板内，每个样品做3个平行，将加好样的全透明微孔板放入微孔板检测系统中，在波长620 nm处测其吸光度。

1.3.3 齿瓣石斛多糖含量的测定

按线性回归方程计算齿瓣石斛多糖含量。

1.3.4 齿瓣石斛多糖提取率的计算试验是以提取齿瓣石斛多糖的提取率作为评价指标，齿瓣石斛多糖提取率根据式（1）计算。

式中：ω为多糖提取率，%；a为糖含量，μg/mL；b为冻干试验量，g；c为冻干后质量，g；d为石斛粉质量，g。

1.3.5 正交试验设计

以提取方式、料液比、提取温度、提取时间、提取次数5个因素，根据不同条件，针对提取方式设置2个水平，料液比和提取温度设置4个水平，提取时间和提取次数设置3个水平，应用正交表生成软件进行试验设计（见表1）。

表1 试验因素及水平

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

由吸光度（x）与浓度（y）进行线性回归分析，如图1所示。其回归方程为y=0.296 4x+0.001 6，相关系数R2=0.999 4，即葡萄糖标准品溶液的浓度与吸光度有良好的线性关系，因此可用此标准曲线计算糖浓度。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 齿瓣石斛多糖含量计算

用样品在波长620 nm处的吸光度带入公式计算得出各个样品的糖含量，如表2所示。

表2 齿瓣石斛不同样品吸光度

接表2

2.3 齿瓣石斛多糖提取率分析

由表2可知，编号为48的样品多糖含量最高，但是，试验是以提取齿辦石斛多糖的提取率作为评价指标，从而判断齿瓣石斛多糖提取的最佳提取工艺，所以经上述试验所得数据计算多糖提取率，按式（1）计算，具体计算结果如表3所示。

表3 齿瓣石斛不同样品多糖提取率

接表3

2.4 正交试验结果

根据因素水平表进行正交试验，试验结果如表4所示。料液比、提取方式、提取温度、提取次数、提取时间均对样品提取多糖的含量有显著影响，影响程度依次为D＞E＞B＞C＞A，即提取时间＞提取次数＞液料比＞提取温度＞提取方式。通过极差分析得到的理论最优组合A2B3C4D1E1，试验验证其多糖提取率（27.197%）不如正交试验最优结果A1B3C4D2E2（提取率30.664%），即超声提取、料液比1∶40（g/mL）、提取温度100 ℃、时间4 h、提取次数2次。由表5方差分析结果可知，通过在0.05显著水平上的检验，提取时间和提取次数2种因素对齿瓣石斛多糖提取得率有显著影响。

表4 正交试验结果

表5 方差分析

以最佳提取条件进行3次平行试验，得到齿瓣石斛多糖提取得率30.66%。说明该提取条件具有较好的合理性和可靠性，适用于齿瓣石斛多糖的提取。

3 结论与讨论

由正交试验分析可知：提取方式、料液比、提取温度、提取次数、提取时间均对样品提取多糖的含量有显著影响，其因素主次顺序为D＞E＞B＞C＞A，即最重要的因素为提取时间，其次是提取次数，再次是料液比、提取温度和提取方式。最终得到的齿辦石斛多糖的最佳提取条件为超声提取、料液比1∶40（g/mL）、提取温度100 ℃、时间4 h、提取次数2次，提取率为30.66%。在此工艺条件下，所得齿瓣石斛多糖提取率较高，具有省时、高效、节能等优点，可为齿瓣石斛深加工提供新的工艺方案。

根据结果得知，提取时间和提取次数对齿瓣石斛多糖提取率有显著的影响。就提取时间而言，提取的时间越长，多糖溶出越多。王洪云等[12]研究也表明提取时间对齿瓣石斛多糖提取率影响最大。提取次数越多，提取效率也越高，因为每次提取都将更换新的溶剂，使得多糖溶出量也随之增加。刘静平等[13]在铁皮石斛类原球茎多糖的提取纯化工艺中同样发现，提取次数对多糖的提取有极显著的影响。秦令祥等[14]采用闪提法提取香菇多糖，结果表明提取次数对香菇多糖的提取率影响较大。石斛提取加工过程中，传统热水回流提取方案溶出率较高，但同时也存在提取时间长、成本高、杂质多、澄清度差等不足之处[15]。超声提取法是利用超声波对细胞进行空化作用，引起细胞的强烈振动，使有效成分加速溶解到溶剂中，具有绿色、高效的特征，从而更好、更快地对多糖进行提取[16-17]。超声提取有利于多糖的迅速溶出和扩散，比回流提取更加省时、高效。孟繁磊等[18]对刺五加多糖的超声提取工艺进行研究，采用超声法提取刺五加多糖的平均提取率为10.87%。叶余原[19]采用超声法提取铁皮石斛多糖，在同样的条件下，超声法比水提法更加高效。孟良玉等[20]对枸杞多糖的超声提取工艺中，同样表明超声提取法可有效提高多糖的得率。因此，该工艺可为齿瓣石斛多糖提取提供一个新方案，为今后的深入加工利用提供一些参考。