白细胞介素-11及其受体在新生缺氧缺血性脑病大鼠模型中的表达*

左丁，冯占辉，王筱雅，陈惠心，胡颖，张金娟，杨清，叶兰***

(1.贵州医科大学 基础医学院 药理学教研室，贵州 贵阳 550025；2.贵州医科大学附属医院 神经内科，贵州 贵阳 550025；3.贵州护理职业技术学院 药物教研室，贵州 黔南州 551300；4.贵州医科大学 基础医学院 多媒体机能学实验室，贵州 贵阳 550025)

新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)是新生儿期严重缺氧性脑损伤的结果，其死亡率和发病率在全球范围内都很高[1-2]。HIE是由脑组织供血和供氧困难引起的，常与癫痫、脑瘫、死亡、短期或长期神经和认知功能障碍有关[3]。目前，对临床相关的HIE的治疗是出生后立即进行亚低温治疗[4-5]，但仅靠亚低温疗法并不能提供完全的神经保护，迫切需要辅助治疗。成功建立HIE疾病模型，了解HIE的病理变化，寻找切实有效的靶点至关重要。白细胞介素-11(interleukin-11，IL-11)是一种具有血小板生成活性的造血细胞因子[6]，在机体多种组织中有表达，包括大脑、脊髓、肠道和睾丸[7]。IL-11通过与细胞表面特异性受体-配体结合链白介素-11受体α(interleukin-11 receptor alpha，IL-11Rα)结合，并连接到信号转导链可溶性糖蛋白130(glycoprotein 130，GP130)后发挥其生物学作用[8]，它们主要通过Janus激酶/STAT3、ERK/RAS和mTOR/PI3K 这3种重要途径进行信号传递[9]。研究表明IL-11作为抗炎因子在各种炎症疾病模型中均表现出抗炎和黏膜保护作用，如黏膜炎、炎症性肠病等[10]。有研究认为，IL-11使少突胶质前体细胞凋亡减少、有丝分裂增强，其对少突胶质细胞的支持作用与对白细胞的抑制作用，使IL-11成为哺乳动物包括多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)等中枢神经系统炎症性疾病的潜在保护因子，但是至今还没有IL-11对HIE疾病作用的相关报道。本研究观察IL-11及受体在新生大鼠HIE疾病模型中的动态变化，为寻找HIE新的协同治疗靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 新生Sprague-Dawley(SD)大鼠30只(12～18 g，7日龄)，由贵州医科大学实验动物中心提供，雌雄各半。所有与动物有关的试验均获贵州医科大学实验室动物伦理委员会的批准。

1.1.2主要试剂和仪器 IL-11Rα(4D12)鼠单克隆抗体(sc-13090)、IL-11(A-9)鼠单克隆抗体 (sc-13306)及GP130(E-8)鼠单克隆抗体(sc-376280)均购自美国Santa Cruz公司，苏木精-伊红(HE)染液套装(G1003)购自武汉赛维尔生物科技有限公司，异氟烷麻醉剂(1902801，购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；R580S型小动物麻醉机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)及AG70厌氧缺氧箱(美国Gene-Science 公司)。

1.2 方法

1.2.1建立HIE大鼠模型 将30只实验动物分为假手术(Sham)组和模型(HIE)组，Sham组9只、HIE组21只。各组7日龄新生大鼠称重后用1%～2%异氟烷麻醉、固定在立体定位仪上，颈部消毒、颈部正中做约5 mm的纵向切口，找到右颈总动脉、用缝合线在近心端和远心端两端分别进行2次结扎、并将其从中间剪断，缝合切口后放回母鼠身边休息；1 h后，在37 ℃恒温水浴下用8%O2和92%N2低氧处理2 h；缺氧结束后，将乳鼠送回母鼠身边；Sham组麻醉及手术，但不结扎右颈总动脉和缺氧，其余步骤同模型组[12]。

1.2.2短期行为学检测 对造模后48 h的新生大鼠实施短期行为学检测，Sham组和HIE组各6只，包括翻正反射[13]、负趋地性试验[14]和Longa评分[15]。

1.2.3HE染色法检测脑组织病理学变化 短期行为学测试结束后，取Sham组和HIE组各3只大鼠处死、取脑组织、4%多聚甲固定、冠状切割成小块备用，切块包含大脑皮层和海马体；然后梯度乙醇脱水和二甲苯透明、石蜡包埋、切片。脱蜡：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ20 min、无水乙醇Ⅰ5 min、无水乙醇Ⅱ 5 min、75%酒精 5 min、自来水洗，切片入苏木素染液染3～5 min、自来水洗，分化液分化、自来水洗、返蓝、流水冲洗；切片依次入85%、95%的梯度酒精脱水各5 min，入伊红染液中染色5 min。脱水封片后显微镜100倍镜检，图像采集分析，细胞核呈蓝色，细胞质呈红色。

1.2.4检测脑组织IL-11、IL-11Rα、GP130蛋白的表达 采用免疫印迹(Western blot)法检测，从Sham组取3只(造模后6 h)，HIE组取15只新生大鼠不同时间点取大脑组织 (造模后6、12、24、48、72 h组)、每个时间点3只，通过蛋白质免疫印迹法检测IL-11、IL-11Rα、GP130的表达变化。(1)制备蛋白质样品 取适量右侧脑组织(包含大脑的海马体和大脑皮层)称重置于玻璃匀浆器中，加入合适体积的RIPA蛋白裂解液进行蛋白质提取，使用BCA定量盒定量并制样；(2)制胶、上样、电泳、转模；(3)孵育一抗、二抗，一抗为IL-11Rα(4D12，1 ∶200)、GP130(E-8，1 ∶100)、IL-11(A-9，1 ∶100)，二抗为碱性磷酸酶山羊抗鼠IgG(H+L，1 ∶10 000)；(4)ECL发光液曝光显影。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 短期行为学表现

HIE组新生大鼠在缺氧缺血性脑损伤后，翻正反射、负趋地性试验时间明显延长，Longa评分升高，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 两组新生大鼠短期行为学表现Tab.1 Short-term behavioral performance of neonatal

2.2 脑组织细胞形态

与Sham组比较，缺氧缺血损伤48 h后,HIE组脑组织严重坏死、脑干组织结构不清楚、大脑皮层显示组织损伤、细胞核固缩、凝集，海马CA1区域中可见多发受损细胞，细胞核集中不规则、排列紊乱。见图1。

注：红色箭头指示受损及坏死细胞。图1 两组大鼠的大脑皮层及海马神经细胞形态Fig.1 Cortical and hippocampal neural cell morphology of rats between two groups

2.3 IL-11蛋白表达

与Sham组比较，缺氧缺血诱导后，HIE组大鼠脑组织IL-11蛋白水平整体呈现先减后增趋势，12 h时组降至最低、从24 h组开始上调、在72 h时显著性升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：(1) 与Sham组比较，P<0.05。图2 各组大鼠脑组织IL-11蛋白表达Fig.2 IL-11 protein expression in the rat brain tissue of each group

2.4 脑组织IL-11Rα和GP130蛋白表达

缺氧缺血损伤后，HIE各组大鼠脑组织匀浆中IL-11Rα和GP130蛋白表达趋势均呈现先增加后减少，在24 h时达到峰值；与Sham组比较，HIE组在24 h时IL-11Rα和GP130蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

注：A为IL-11Rα蛋白，B为GP130表达；与Sham组比较，(1) P<0.01，(2) P<0.05。图3 各组大鼠脑组织IL-11Rα及GP130蛋白的表达Fig.3 Expression of IL-11Rα and GP130 protein in the rat brain tissue of each group

3 讨论

新生儿缺氧缺血性脑病的发病机制与炎症相关，包括巨噬细胞的活化[16]。随着自由基和细胞外谷氨酸水平增高，星形胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞被激活，释放炎症细胞因子[17]。另外细胞死亡包括细胞坏死和细胞凋亡，是导致新生儿脑损伤的重要原因。文献表明HI造成大量神经元凋亡，在不成熟的大脑组织中半胱氨酸蛋白酶caspase-3对凋亡的调控起重要作用[18]。本实验短期行为学结果表明，HI后新生大鼠的整体运动协调能力下降，神经认知功能发生障碍。HE结果显示，新生大鼠脑组织在缺氧缺血损伤后，海马CA1区和皮层区均受到不同程度的损伤，导致细胞水肿、坏死，细胞形态不规则。病理结果证实HI早期造成大量的神经细胞凋亡，这与缺氧缺血损伤后脑病理形态变化的研究结果一致[19]。有学者对不同缺血疾病模型中IL-11时间进程变化进行了研究，肺缺血再灌注显示缺血损伤后前6 h IL-11的表达总体呈上升趋势[20]；在大脑中动脉栓塞模型的研究中，呈现先减后增趋势[21]。本实验通过蛋白质印迹法检测内源性IL-11在HI后的时间进程表达水平，与Zhang Bei等[22]研究结果相似，本研究推测脑缺氧缺血损伤不仅可以增加炎症因子的释放，同时也会产生抗炎因子进行自身防御。有研究显示GP130mRNA在动物的锥体细胞层和颗粒细胞层的神经元中表达，并且在短暂性前脑缺血后GP130mRNA表达上调[23]。但未发现IL-11Rα在相关缺氧/缺血模型中的检测。为了确定IL-11靶向结合的两个受体在大脑内的存在和表达情况，本实验也检测了内源性IL-11Rα和GP130蛋白在HI后的时程表达变化，结果提示两者都在HI后6 h开始增加且在24 h蛋白表达达到峰值，其后开始降低。由此推测此靶点在新生大鼠脑内是存在的，并参与了HIE疾病模型的病程变化，提示IL-11可能作为治疗新生儿缺氧缺血性脑病的重要研究靶点，这具有重要的临床意义。