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嗜黏蛋白阿克曼菌对腺嘌呤诱导慢性肾病大鼠作用的研究

2023-03-27高增辉秦珍珍栗凤霞

医学研究杂志 2023年2期
关键词:阿克曼肾脏病屏障

高增辉 秦珍珍 栗凤霞

慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)是威胁人类健康的全球性重要公共卫生问题,在全球不同地区其发生率高达6%~10%,目前尚无根治方法,最终进展至终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)[1]。近年来研究显示,CKD患者本身肠道微生态失调及其肠道屏障功能受损,进一步加重了慢性肾脏病的进展[2]。

肠道微生态与人体的生理病理过程密切相关,具有营养肠上皮细胞、维护肠道屏障、免疫调节等作用[3]。既往有研究表明,肠道微生态失调与人体消化、心血管、内分泌及神经等系统疾病密切相关[4]。有研究者发现肠道微生态失调会造成肠道屏障破坏及通透性增加,导致病原体或其毒性代谢产物进入血液循环,进而加重疾病进展[5,6]。而笔者前期研究发现,CKD患者和健康对照者肠道微生态在多样性和菌群结构存在明显差异,CKD患者中阿克曼菌的丰度较健康对照组显著降低[7]。本研究旨在探讨阿克曼菌对CKD大鼠肾功能的影响作用及其可能机制,为CKD的预防及治疗提供新的思路。

材料与方法

1.一般材料:健康6周龄SPF级SD大鼠26只,平均体质量约200g,购自山西省人民医院实验动物中心,许可证号:SCXK(晋)2019-0001。免疫印迹、免疫组化及病理染色等相关试剂购自赛文创新(北京)生物科技有限公司。ZO-1抗体(批号UH289284)及Claudin-1抗体(批号UB280983)购自美国赛默飞世尔科技公司公司,Occludin抗体(批号EPR20992)购自英国Abcam公司,β-actin抗体、羊抗兔二抗及羊抗鼠二抗购自美国Immunoway Biotechnology公司(批号YM3028)。

2.A.muciniphila株的培养:A.muciniphila株培养物购自德国微生物菌种保藏中心。培养条件37℃,厌氧袋内,在哥伦比亚琼脂培养基平板上培养48~72h。

3.动物分组及干预措施:26只SD大鼠随机分为正常组8只、模型组8只、治疗组10只,普通饲料喂养。正常组:予以灌胃0.9%氯化钠溶液 1ml/d,4周;模型组:予以灌胃腺嘌呤200mg/(kg·d),4周;实验组:同时予以灌胃腺嘌呤200mg/(kg·d)和阿克曼菌1.5×109菌落形成单位/天(CFU/d),4周。实验期间观察精神状态、每周测量体质量。4周后使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,心脏穿刺采取大鼠血清,以下腹部正中切口入腹,切除左侧肾组织称重、同一节段结肠组织,-80℃冻存待检。本实验中动物处置方法符合动物伦理学标准,经山西省人民医院医学伦理学委员会批准(伦理审批号:2021省医科伦审字第29号)。

4.血清学指标检测:采用全自动生化分析仪检测血清肌酐(serum creatinine,Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)指标,根据说明书处理样品和标准品。

5.Masson染色和过碘酸希夫(PAS)染色检查肾脏及结肠组织病理学:Masson染色:常规脱蜡水化,用Regaud苏木精染色,丽春红酸性复红液10min,冰醋酸水溶液浸洗,钼酸水溶液分化,不经水洗,直接用苯胺蓝染液复染,以冰醋酸水溶液浸洗片刻,封片及镜检。以损伤的肾间质胶原沉积面积与肾间质总面积的比值表示,0分为无病变;1分为局灶性(≤总面积25%),2分为多灶状(25%~50%),3分为大片状(50%~75%),4分为弥漫性(>75%),随机观察10个高倍镜视野进行评分。PAS染色:石蜡组织切片常规脱蜡水化,过碘酸溶液中10min,希夫染液中18min,苏木精染液10s,分化液5s,进行脱水、透明、封片及镜检。

6. Western blot法检测大鼠结肠ZO-1、Occludin、Claudin-1的表达:取适量结肠组织加RIPA裂解液,快速低温匀浆,BCA法检测浓度,取50μg总蛋白,行SDS-PAGE凝胶电泳后,转膜,5%脱脂奶粉液封闭,加入一抗(ZO-1稀释比1∶250、Occludin稀释比1∶1000、Claudin-1稀释比1∶125)4℃孵育过夜。次日,加入二抗(羊抗兔吸稀释比1∶10000、羊抗鼠稀释比1∶10000)室温孵育1.5h。超敏增强型化学发光试剂(ECL)显色影,用ImageJ软件对条带进行半定量分析。结果以与β-肌动蛋白(β-actin稀释比1∶10000)的灰度比值表示。

7.免疫组化检测结肠组织ZO-1、Occludin、Claudin-1的表达:石蜡组织切片脱蜡水化,3%H2O210min。Tris/EDTA缓冲液,高压修复。一抗(ZO-1稀释比1∶62.5、Occludin稀释比1∶200、Claudin-1稀释比1∶100)孵育,4℃过夜。HRP标记二抗(羊抗兔稀释比1∶1000)。DAB显色,苏木精10s,常规透明,封片。德国莱卡光学显微镜下双盲法观察切片中表达棕黄色颗粒的阳性细胞数情况,随机观察10个高倍镜视野。根据文献[7]染色评分标准如下:分别计数阳性细胞百分比(A)及阳性着色程度(B)。A:无阳性细胞记为0,阳性细胞比例0~1%记为1,阳性细胞比例2%~10%记为2,阳性细胞比例11%~30%记为3,阳性细胞比例31%~70%记为4,阳性细胞比例71%~100%记为5。B:阴性着色记为0,弱阳性染色记为1,中等强度染色记为2,强阳性染色记为3,总评分=阳性细胞比例评分+阳性染色强度评分。

结 果

1.大鼠Scr和BUN水平变化:模型组Scr、BUN水平明显高于正常组(P<0.01)。与模型组比较,经阿克曼菌干预后,实验组Scr、BUN下降(P<0.01,表1)。

表1 3组大鼠Scr和BUN的比较

2.大鼠肾组织病变情况:PAS及Masson染色结果显示,与正常组比较,模型组肾小管有不同程度的扩张,肾小管基膜增厚、屈曲,上皮细胞体积缩小,肾间质弥漫性纤维组织增生以及部分炎性细胞浸润(P<0.01);与模型组比较,经阿克曼菌干预后,实验组肾脏组织肾小管扩张减少,肾小管基膜变薄,肾间质纤维化程度减轻(P<0.05,图1)。

图1 3组大鼠PAS及Masson染色结果(×400)*P<0.05,**P<0.01

3.Western blot法验证A.muciniphila对肠道屏障的保护功能:结肠紧密连接位于上皮细胞顶部,参与维持肠道屏障,其中ZO-1、Occludin、Claudin-1是反映细胞间紧密连接完整性的敏感指标。实验结果显示,与正常组比较,模型组结肠组织ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白的表达明显减少(P<0.05);与模型组比较,实验组ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白的表达增多(P<0.05,图2及表2)。

表2 3组大鼠结肠紧密连接蛋白表达

图2 大鼠肠道紧密连接蛋白表达

4.大鼠结肠组织中ZO-1、Occludin、Claudin-1的表达情况:免疫组化结果显示,与正常组比较,模型组结肠组织ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白的表达明显减少(P<0.05),实验组大鼠结肠组织ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白的表达增多(P<0.05,图3)。

图3 3组大鼠结肠组织紧密连接蛋白免疫组化染色及统计结果(×400)*P<0.05

5.A.muciniphila对大鼠结肠组织黏液层厚度及杯状细胞的改善:与正常组比较,模型组结肠腺体萎缩、变形,黏液层厚度明显减低,杯状细胞密度降低(P<0.01);与模型组比较,阿克曼菌干预的大鼠结肠组织黏液层厚度增加(P<0.05),杯状细胞密度升高(P<0.01,图4)。

图4 3组大鼠结肠组织PAS染色(×400)及统计图A.3组大鼠结肠组织PAS染色结果;B.结肠组织黏液层厚度统计图;C.结肠组织杯状细胞密度*P<0.05,**P<0.01

讨 论

目前,慢性肾脏病已经成为一项日益严重的全球性公共健康问题,我国慢性肾脏病患病率约为10%,且仍有逐年上升趋势,已成为我国目前不容忽视的慢性疾病之一[8]。CKD患者由于饮食和肠腔环境有毒物质、pH值、抗生素应用、铁吸收等的长期作用会出现肠道黏膜局部水肿糜烂,肠道微生态的多样性紊乱,同时损伤肠道上皮细胞以及细胞之间的紧密连接,使肠道的渗透性增高,导致肠腔内的细菌和内毒素渗透入血循环中,加重疾病的进展[9,10]。

人体肠道微生态系统由肠道及庞大的微生物群落组成,它包含有300~500个细菌物种,是人体微生态系统最重要的组成部分。已有研究证明,肠道微生物可通过维持肠道屏障完整性,调节肠道局部免疫力,逆转肠道微生态失调,抑制病原体的繁殖等机制,发挥着保护机体的重要作用[10]。研究研究发现膳食纤维、木炭吸附剂AST-120可通过调节肠道紧密连接蛋白表达改善肠道的通透性,进而延缓慢性肾脏病的进展[11,12]。另有研究发现,通过果糖诱导的代谢综合征可致菌群紊乱、肠道屏障破坏,进而加重肾脏病的进展[13]。此外,有研究发现Lactobacillus菌可通过调节肠道环境,促进肠道紧密连接蛋白和TLR2的表达,降低肠道通透性,从而延缓CKD大鼠的肾损害[14]。

前期笔者通过高通量测序技术对56例CKD患者和38例健康对照者的粪便进行比较分析,发现CKD患者的肠道微生态的多样性和菌群结构均发生变化。与健康对照者比较,CKD患者中阿克曼菌的丰度较健康对照组显著降低(3.08% vs 0.67%)[15]。阿克曼菌是从人粪便中分离出的严格厌氧的肠道益生菌,它可以编码一种特别广泛的黏蛋白降解酶,降解黏液中的黏蛋白,产生短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFA),而短链脂肪酸具有减轻肠道炎症、增强免疫以及抗肿瘤的作用[16,17]。

研究表明,阿克曼菌可以通过改变肠道微生态的多样性和丰富度,逆转肠道微生态,改善肝脏疾病的进展[18]。本研究发现,模型组大鼠结肠紧密连接相关蛋白表达明显低于正常组,而阿克曼菌使得CKD大鼠结肠紧密连接蛋白中的胞内蛋白ZO-1、跨膜蛋白Occludin、Claudin-1表达增加,提示阿克曼菌干预可改善结肠上皮细胞间紧密连接完整性,改善肠道屏障功能。此外,有研究发现,在乙醇诱导的酒精性肝病大鼠中,予以阿克曼菌干预可减少肝功能损害及炎性细胞浸润,促进紧密连接蛋白的表达,降低肠道渗透性,治疗酒精引起的肝损害[19,20]。而本研究结果示,在阿克曼菌干预下,大鼠结肠组织杯状细胞密度及黏液层厚度较模型组显著增加,说明阿克曼菌可通过增加结肠上皮表面黏液生成,促进肠道屏障功能的恢复,减少有毒物质进入血液循环,从而改善CKD大鼠的肾损害。

综上所述,本研究发现阿克曼菌可改善慢性肾脏病大鼠的肾功能以及肾间质纤维化,其作用机制可能与阿克曼菌改善肠上皮细胞间紧密连接结构的完整性、增加肠道上皮细胞分泌黏液进而保护肠道黏膜屏障功能有关。应用阿克曼菌保护慢性肾脏病患者的肠道屏障功能,可以为通过调节肠道益生菌分布延缓慢性肾脏病进展及改善预后等方面的进一步研究提供实验基础。

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