绿色木霉预处理协同外源氢对秸秆厌氧发酵产气性能提升的影响

施付艳，苏小红，王 欣，孟利强，刘 泽，王 雪，陆 佳，刘 伟*

(1.黑龙江省能源环境研究院，哈尔滨 150000；2.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150000)

我国是农业大国，秸秆资源丰富，年均产量约为8.65亿t[1-3]。在我国广大农村地区农户大规模露天焚烧废弃农作物秸秆已成为显著的社会问题[4]，秸秆焚烧不仅对土壤造成影响，还易引发火灾，导致人身财产损失，影响群众生活和空气质量[5-7]，秸秆中含有较高的有机质，其资源化利用一直是我国研究和讨论的热点。

农业秸秆的主要成分是木质素、纤维素及半纤维素[8]，三者通过化学键紧密缠绕包裹形成难以降解的木质纤维素结构，是秸秆资源化利用的天然屏障。木质素主要存在于植物细胞壁中，给植物提供结构支撑，因其具有抗渗，抗微生物，抗氧化，非水溶性和无光学活性等特性，使得很难降解[9-10]。纤维素和半纤维素包裹于木质素中，且纤维素、半纤维素和木质素分子之间存在着不同的结合力，极大地阻碍了玉米秸秆的厌氧发酵性能，降低了秸秆的利用率[11-12]。苏小红[13-15]等的研究中表明预处理过程可将秸秆中的纤维素-半纤维素-木质素结构破坏，使得纤维素与半纤维素更多地暴露出来，为后续厌氧发酵产能过程提供了条件，可有效提高厌氧发酵产能效益。

生物预处理是既环保又有效的预处理方法之一，其中木霉预处理是利用木霉菌分泌的纤维素酶对秸秆中的木质纤维素进行降解，将秸秆中复杂的多聚糖分解为便于利用的单糖[16]。经过预处理后的秸秆在厌氧发酵过程中通过水解酸化、产氢产乙酸及产甲烷3个步骤实现生物质能源的转化，生产出清洁能源甲烷[17]。此外，俞游[18]等的研究表明外源加入氢气可以促进厌氧发酵中食氢产甲烷途径，从而提升厌氧发酵甲烷产量。

本实验以还原糖为指标探索了木霉预处理玉米秸秆的最佳初始料液比、处理时间和处理温度，通过正交实验得到最佳预处理条件组合，在此基础上进行厌氧发酵产甲烷实验及加氢厌氧发酵实验，分析木霉预处理和外源加氢对玉米秸秆厌氧发酵产甲烷的影响，为秸秆厌氧发酵产甲烷预处理技术的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

采用自然条件下风干的玉米秸秆作为实验材料。取自黑龙江省哈尔滨市松北区松花江村的玉米农田，粉碎成2～3 cm的小段，并取适量置于250 mL锥形瓶中，用6层纱布封口，于121℃高压蒸汽灭菌30 min。

玉米秸秆理化性质如表1。

表1 玉米秸秆理化性质 (%)

厌氧发酵接种物选择黑龙江省能源环境研究院正在运行的厌氧发酵中试平台的沼液。

绿色木霉(Trichodermaviride)来自本实验室驯化培养，由黑龙江省科学院微生物研究所提供源菌株。

1.2 实验设计

1.2.1 木霉预处理秸秆实验设计

本实验通过改变绿色木霉预处理玉米秸秆的初始料液比、预处理温度及预处理时间，进行单因素及正交实验，优化绿色木霉预处理玉米秸秆条件，具体方案如下。

1.2.1.1 单因素实验设计

木霉预处理玉米秸秆单因素实验设计见表2。

表2 木霉预处理玉米秸秆单因素实验因素水平选取表

1.2.1.2 正交实验设计

木霉预处理玉米秸秆正交实验设计见表3。

表3 木霉预处理玉米秸秆正交实验因素水平选取表

1.2.2 发酵实验设计

将预处理后的玉米秸秆进行厌氧发酵产甲烷潜力分析，未经过预处理的玉米秸秆作为对照组，同时设置一组预处理秸秆进行外源加氢厌氧发酵产甲烷实验，每个样品做3个平行。厌氧发酵装置采用全自动产甲烷分析测试系统(AMPTSII°碧普仪器有限公司)，发酵温度为55℃，发酵总固体含量(TS)为8%，发酵15 d。加氢组每日通气2次，每次通气45 mL，通气时间为2 min。

1.3 实验装置

1.3.1 预处理实验装置

预处理实验装置见图1。

图1 预处理实验装置

1.3.2 厌氧发酵实验装置

本实验使用AMPTSII°产甲烷潜力分析测试系统(型号01-0000-02，瑞典)作为厌氧发酵实验装置，具体如图2所示，由恒温水浴发酵装置、CO2脱除装置及甲烷产量计量装置组成。

1.4 实验方法

1.4.1 菌悬液制备

PDA培养基配制：土豆洗净削皮取200 g，加入1000 mL蒸馏水煮沸30 min，以两层纱布过滤得滤液，加入20 g葡萄糖。固体培养基加入15～20 g琼脂粉。

菌液制备：取实验室封存的绿色木霉菌液200 μL接种于PDA液体培养基中于28℃摇床培养48 h，再次取200 μL活化菌液接种于PDA固体培养基中，于28℃恒温培养48 h，挑取单菌落接种于事先准备的PDA液体培养基中，于28℃恒温培养箱培养72 h(调整菌液浓度为7.5×107个·mL-1)，用于玉米秸秆预处理。

1.4.2 基质液制备

取2 g预处理后玉米秸秆，加入蒸馏水20 mL，于28℃，140rpm振荡浸提1 h，用5 mL注射器抽取混合液，经0.45 μm滤膜进行过滤得基质液，用于还原糖测定。

1.4.3 指标测定

纤维素、木质素及半纤维素测定：范氏Van Soest纤维素测定法[19](ANKOM220型半自动纤维素分析仪)；还原糖含量测定：DNS(3，5-二硝基水杨酸)比色法[20]；干物质含量(TS含量)测定：烘干法(电热恒温鼓风干燥机，102℃±3℃，4 h)；挥发性固体含量(VS含量)测定：烘干法(马弗炉，600℃，2 h)；气体成分产气量：岛津气相色谱仪。

2 实验结果与分析

2.1 初始料液比对木霉预处理玉米秸秆还原糖含量的影响

初始料液比决定玉米秸秆基质中水分的含量，张玉辉[21]等的研究表明基质中水分含量过高，会导致基质透气性下降，氧气供给不足，使菌体生长不良，产酶能力下降，还原糖得率下降；水分含量过低，木霉菌产生的纤维素酶不能进行有效传质作用于基质表面。从图3可知，还原糖含量随着初始料液比的升高呈下降趋势，当初始料液比为1∶6时，木霉预处理所产还原糖含量最低为0.44 mg·g-1，此时基质中水分含量过高，抑制了木霉菌在基质中的生长繁殖，不能产生纤维素酶对玉米秸秆进行降解。当料液比为1∶2时，还原糖含量最高为10.34 mg·g-1，表明在该料液比条件下木霉菌生长活性旺盛，产生的纤维素酶可对玉米基质进行有效降解，转化还原糖的能力提高。

图3 初始料液比对预处理后秸秆还原糖含量的影响

2.2 温度对木霉预处理玉米秸秆还原糖含量的影响

纤维素酶活性和木霉生长活性与预处理温度关系密切。越靠近最适酶活温度，纤维素酶的吸附和纤维素糖化效果越好[22]；越靠近最适生长温度条件，木霉生长繁殖对还原糖消耗越大。图4表明，木霉预处理玉米秸秆还原糖含量随温度增加而呈上升的趋势，当预处理温度为38℃时，还原糖含量最高为17.78 mg·g-1。在该温度条件下，纤维素酶活性增大，对玉米秸秆基质降解效果增强，因此还原糖含量明显增加。当预处理温度为23℃时，木霉预处理玉米秸秆还原糖含量出现最低值0.91 mg·g-1，其原因可能是该预处理温度适宜木霉生长而不适宜纤维素酶的产生，木霉菌的生长繁殖对原基质中的还原糖和酶降解产生的少量还原糖进行消耗，导致还原糖含量降低。赵爽[23]关于两种不同来源绿色木霉固态发酵及甘草药渣对玉米生长效应的研究同样表明纤维素酶最佳反应温度高于木霉最适生长温度。

图4 温度对预处理后秸秆还原糖含量的影响

2.3 预处理时间对木霉预处理玉米秸秆还原糖含量的影响

木霉预处理玉米秸秆时间越长，微生物对还原糖的消耗越多。从图5可看出，当预处理时间为2 d时，还原糖含量最高为6.27 mg·g-1，当预处理时间为10 d时，还原糖含量最低为0.95 mg·g-1。该结果与赵爽[24]等人的研究结果相同，其原因是预处理时间越长，木霉菌繁殖数量增多，对基质中原有的还原糖及纤维素酶降解产生的还原糖消耗越大，因而累计还原糖含量减少。

图5 时间对预处理后秸秆还原糖含量的影响

2.4 木霉预处理条件优化

根据单因素实验结果设计三因素三水平正交试验，采用L9(33)正交表考察各因素之间的相互作用，得到9个正交试验组，结果见表4。

从表4可以看出，最佳木霉预处理条件为温度36℃，处理时间为2 d，初始料液比为1∶1。3个因素对木霉预处理影响顺序为RA、RC、RB，即温度>初始料液比>处理时间。对实验结果进行方差检验数据结果如表5，可看出温度对实验影响显著(p<0.05)。以温度36℃、处理时间2 d、初始料液比1∶1进行验证性试验，还原糖含量为27.66 mg·g-1，高于正交表中所有试验。

表4 木霉预处理玉米秸秆正交实验设计及结果

表5 正交试验方差分析表

2.5 木霉预处理对厌氧发酵产甲烷的影响

对木霉预处理的玉米秸秆进行厌氧发酵产甲烷实验及外源加氢产甲烷实验，分析木霉预处理玉米秸秆的产甲烷性能。从图6可知，木霉预处理玉米秸秆产甲烷效果显著，与未经预处理的实验组相比，木霉预处理组产甲烷高峰出现在第4天，产甲烷高峰稍有滞后。自第4天起，木霉预处理组日产甲烷量均高于未预处理实验组，其原因可能是在厌氧发酵过程中，预处理组挥发性脂肪酸的产生速度大于其消耗速度，导致挥发性脂肪酸累积，从而影响了原料的产甲烷效果，之后随着挥发性脂肪酸的消耗，解除了其所产生的抑制，复杂有机物逐渐被厌氧菌群消化，产甲烷能力恢复，产甲烷量升高[25]。比较木霉加氢组可看出，外源氢气对预处理后玉米秸秆厌氧发酵产甲烷效果提升显著，日产甲烷量均高于木霉预处理未加氢组和未预处理组。其原因是外源氢气的加入促进了嗜氢产甲烷菌对氢气和二氧化碳的转化，从而实现了甲烷产量的提升。乔玮[26]等人的研究表明氢气通入对嗜氢厌氧途径有促进作用。木霉预处理组最大日产甲烷量为22.20 mL·g-1d-1，较未预处理组提高了56.8%。木霉加氢组最大日产甲烷量为34.57mL·g-1d-1，较未加氢组提高了55.7%。表明木霉预处理可有效提高玉米秸秆降解能力，提升产甲烷潜力，外源加氢对厌氧发酵产甲烷有显著促进作用。

图6 木霉预处理对日产甲烷量的影响

由图7可知，木霉预处理组、木霉加氢组与未预处理组累积产气量的变化趋势一致，都是先快速增长后趋于平稳。在第4天之前，未预处理组累积产气量高于木霉预处理组，而第4天之后，木霉预处理组累积产气量超过干秸秆组。木霉预处理组累积产气量为65.96 mL·g-1TS，未预处理组累积产气量为47.46 mL·g-1TS，产气量提高39.0%。黄文博[27]等利用白腐菌对玉米秸秆进行前期预处理以提高沼气产气量研究中，经过白腐菌处理后的玉米秸秆在厌氧发酵试验中的累积产气量较未经处理的空白对照组提高了12.32%；赵肖玲[28]等利用黑曲霉与木霉复合菌剂处理秸秆提高产甲烷性能研究中发现，经过微生物处理后的玉米秸秆在厌氧发酵中的累积产气量较未经微生物处理的对照组提高了10.06%。李靖[29]等复合微生物菌剂对玉米秸秆的预处理与厌氧产气性能的研究中，经过复合微生物菌剂CM-2预处理后的玉米秸秆在厌氧发酵中的累积产气量与未经预处理的对照组相比提高了30.18%。由此可见，木霉预处理可有效提升玉米秸秆的累积产甲烷量。比较图7中甲烷累计产气量变化趋势，木霉加氢组均高于木霉预处理未加氢组和未预处理组，木霉加氢组甲烷累积产气量为173.77 mL·g-1TS，为木霉预处理组的2.6倍，表明外源加入氢气可有效提升厌氧发酵甲烷产量。

图7 木霉预处理对甲烷累积产气量的影响

3 结论

本文研究了绿色木霉预处理及外源氢气对玉米秸秆厌氧发酵产甲烷性能的影响，通过分析还原糖产量和产甲烷量，优化了预处理条件，得到绿色木霉最佳预处理条件为：预处理温度36℃，初始料液比1∶1，预处理时间2 d，在此预处理条件下，还原糖产量为27.66 mg·g-1，绿色木霉预处理组最大日产甲烷量为22.20 mL·g-1d-1，较未预处理组提高了56.8%，累积产甲烷量为65.96 mL·g-1TS，较未预处组提高了39.0%，绿色木霉加氢组最大日产甲烷量为34.57mL·g-1d-1，较绿色木霉预处理组提高了55.72%，累积产甲烷量为173.77 mL·g-1TS，为绿色木霉预处组的2.6倍。上述结果表明，绿色木霉预处理可有效提升秸秆厌氧发酵产甲烷潜力，外源氢气对厌氧发酵产甲烷有显著促进作用，可为秸秆类生物质厌氧发酵产甲烷提供理论支持。