生信分析肾阳虚型绝经后骨质疏松症分子机制及淫羊藿的靶向治疗机制

蒋 俊，毛国庆

（南京中医药大学附属医院骨伤科，江苏 南京 210000）

绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是指女性绝经后发生骨组织结构改变、骨量减少及骨的脆性增强的一种疾病，其原因是雌激素水平的下降，多于女性绝经后5～10 年发生[1]。骨折是PMOP 并发症中最严重的一种，在缩短患者生存周期的同时，严重影响患者的身心健康。2018年全国首次骨质疏松流行病学调查结果显示[2]，我国50 岁以上男性骨质疏松患病率仅为6.0%，而同年龄段女性患病率高达32.1%。因此，PMOP 的防治不仅是一个健康问题，而且是一个社会问题。传统医学中没有“骨质疏松”的病名记载，但根据其病因病机、发病特点及临床症状，目前常认为其属于中医“骨痿”“骨枯”“骨蚀”等范畴。中医认为骨质疏松发生的根本病因是肾虚。《黄帝内经》中提及：“肾主骨，生髓。”因此，肾虚会导致生髓功能的减弱，进而引起骨髓空虚，骨强度减弱，最终导致骨质疏松症。根据相关统计[3]，淫羊藿在防治PMOP 的中药复方中占很大比例，许多临床防治PMOP 的验方中都含有淫羊藿，其使用频率仅次于熟地黄位居第2 位，是治疗肾阳虚型PMOP 的最基础药物。淫羊藿属于小蘖科植物，亦称“仙灵脾”，《中国药典》中记载其性味辛甘温，归肝肾经，有壮肾阳、强筋骨、祛风湿的功效。淫羊藿中有效成分复杂。现代药理学研究发现[4]，淫羊藿苷是淫羊藿中含量最高的成分，能够抑制卵巢摘除大鼠的骨丢失，减缓骨密度下降，改善骨骼力学性能和骨小梁微结构。尽管目前有很多关于淫羊藿与PMOP 相关的研究报道，但其治疗肾阳虚型PMOP 的作用机制仍不是十分明确。因此，本研究借助网络药理学深入分析其作用靶点及作用通路，从整体论治淫羊藿与肾阳虚型PMOP 的关联性，为临床应用和后续试验研究提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 资料来源及差异基因分析 在公共基因芯片数据库（gene expression omnibus，GEO）中，以“postmenopausal osteoporosis”“kidney yang dificiency”为检索词，设定筛选条件为人（Homo spaiens）进行搜索，检索到GSE56116 芯片数据集。该数据集由13例样本构成，其中10 例绝经后骨质疏松症患者分为肾阴虚（4 例）、肾阳虚（3 例）、非肾虚（3 例）3 组，另外3 例为绝经后健康妇女。从GEO 数据库中下载GSE132550 的基因表达谱，利用limma 包对绝经后健康妇女及肾阳虚绝经后骨质疏松症妇女进行差异基因分析，标准设定为|logFC|≥1且P＜0.05，结果以火山图呈现。

1.2 肾阳虚型PMOP 靶点获取 在GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）及OMIM数据库（https://www.omim.org/）中，以“postmenopausal osteoporosis”为关键词进行检索并收集PMOP 的相关基因，结果与1.1 中的差异基因进行匹配，得到重合部分基因即为肾阳虚型PMOP 的靶点。

1.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建 将获得的肾阳虚型PMOP 靶点输入STRING 数据库（https://cn.string-db.org/）中，选择物种为人类（Homo spaiens），隐藏未连接的节点，其他参数选择默认设置，进行蛋白互作分析，结果导入3.9.0 版本Cytoscape 软件中可视化，利用Cytoscape 软件cyto－Hubba 插件获得连接度值前10 的核心靶点。

1.4 GO 及KEGG 富集分析 将肾阳虚型PMOP 的靶点输入到DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/）中，选择人类（Homo spaiens）且P＜0.01，进行GO 生物过程和KEGG 通路富集分析，分析肾阳虚型PMOP 的潜在病理机制。

1.5 淫羊藿活性成分及潜在靶点筛选 在TCMSP 数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）搜索淫羊藿（Epimrdii Herba）的化学成分，设置筛选条件：口服利用度（OB）≥30%及类药性（DL）≥0.18，初步筛选出淫羊藿的活性成分及其作用靶点。运用R 软件对连接度值前10 的肾阳虚型PMOP 核心靶点进行匹配映射，获得潜在治疗靶点。

1.6 计算机分子对接 在PDB 数据库（http://www.rcsb.org/）及PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中，分别下载潜在治疗靶点蛋白3D 结构pdb 格式文件及化合物3D 结构的sdf 格式。使用DockThor 进行分子对接。

2 结果

2.1 差异表达基因 在GEO 数据库中最终得到肾阳虚型PMOP 的基因表达芯片（GEO 编号：GSE56116），对其进行分析，结果显示肾阳虚型PMOP 患者低表达基因有313 个，高表达196 个，见图1。

图1 差异表达基因火山图

2.2 肾阳虚型PMOP 靶点 在GeneCards 数据库获得肾阳虚型PMOP 靶点1153 个、OMIM 数据库获得肾阳虚型PMOP 靶点45 个，去除重复，共得到PMOP 相关靶点1187 个，将肾阳虚型PMOP 差异表达基因与PMOP 靶点导入Venny 2.1，获得48 个交集靶点，即为肾阳虚型PMOP 的靶点，见图2。

图2 肾阳虚型PMOP 靶点

2.3 PPI 网络 将48 个肾阳虚型PMOP 靶点基因导入STRING 数据库在线进行互作分析，共得到35 个节点，90 条连线，见图3，其中连线表示蛋白质与蛋白质之间的相互作用的证据，节点表示蛋白质，相互关系计数越多，说明该靶点基因在治疗肾阳虚型PMOP 中起到的作用越重要，利用Cytoscape 软件cytoHubba 插件筛选出连接度值前10 的核心靶点基因，见表1。

表1 肾阳虚型PMOP 核心靶点

图3 肾阳虚型PMOP 靶点基因PPI 网络

2.4 富集分析结果 GO 富集分析得到42 个结果，分别选择展示前5 个基因功能，见图4，生物学过程主要为参与细胞增殖、细胞迁移过程调节等；细胞组分主要有细胞外区域、外泌体等；分子功能主要有蛋白酶结合、整合素结合等。KEGG 通路富集分析得到6个结果，见图5，富集的通路有PI3K-Akt 信号通路、Th17 细胞分化、化学致癌受体激活、脂质与动脉粥样硬化、哮喘、类风湿性关节炎相关通路。

图4 GO 富集分析

图5 KEGG 富集分析

2.5 淫羊藿活性成分及潜在靶点筛选 按条件筛选获得淫羊藿活性成分23 种，治疗靶点467 个，将治疗靶点与连接度前10 的肾阳虚型PMOP 核心靶点导入Venny 2.1，得到潜在治疗靶点EGF、CRP、FOS、MMP1，对应活性成分为槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）。

2.6 小分子结构文件获取及分子对接 将槲皮素、木犀草素、山柰酚分别与潜在靶点基因EGF、CRP、FOS、MMP1 两两组合，进行分子对接，见表2。一般默认当配体与受体结合的构象越稳定时，结合能值越小，发生作用的可能性越大，对接结果显示对接能量均低于-5 kJ/mol，说明药物活性成分与疾病靶点能够良好结合。根据最低结合能的结果，与槲皮素亲和力最高的是EGF、与山柰酚亲和力最高的是EGF、与木犀草素亲和力最高的是CRP。

表2 分子对接结果（kJ/mol）

3 讨论

传统医学没有“绝经后骨质疏松”的病名记载，但根据其周身疼痛，弯腰驼背，不能负重，易发骨折等表现，常常将其归于“骨痿”“骨枯”“骨蚀”“骨疏”等范畴，其中尤其与“骨痿”类似。《素问·上古天真论》所载：“女子七七，任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭。”故中医理论认为女子绝经后，天癸衰竭，肾虚精亏，骨髓化源不足，骨骼失于荣养，导致骨量减少，发为本病。《景岳全书·痿论》中说：“肾者，水脏也，今水不胜火，则骨枯而髓虚，故足不任身，发为骨痿。”亦认为PMOP 的根本病因是肾精亏虚，肾虚则不能生髓，髓不能养骨则骨枯，最终发展为骨痿。淫羊藿作为治疗肾阳虚型PMOP 的常用药物，疗效显著，但其具有多成分、多靶点相互作用的特点，活性成分群与作用机制尚不清晰，限制了其临床推广使用。本研究借助网络药理学的方法，拟阐明淫羊藿的作用，探讨其干预肾阳虚型PMOP 的作用机制。

本研究发现，肾阳虚型PMOP 患者血液样本中表达下调基因有313 个，上调基因有196 个，将其与PMOP 相关基因进行映射匹配，结果得到肾阳虚型PMOP 相关的靶基因48 个，对获得的48 个靶点构建PPI 网络。结果显示，EGF、FGF2、CRP、VWF、ITGB3、IRS1、MMP1、SELP、FOS、PRL 等靶点具有较高度值，可能是肾阳虚型PMOP 的核心靶点。研究证明[5]，EGF 是一种单链低分子多肽，能够与受体EGFR 结合促进细胞增殖和组织修复。当EGF 与EGFR 相结合时，EGFR/MEK/ERK1/2 信号通路会被激活，进而诱导成骨细胞增殖[6]。CRP 是一种炎症因子，能够代表机体的炎症水平。韩学明等[7]发现，hs-CRP 水平与绝经后女性的骨密度存在高度相关性。同时既往研究发现慢性炎症疾病可造成RANKRANKL-OPG 轴失衡，促进破骨细胞生成，增强骨吸收，最终导致PMOP 的发生[8，9]。MMP1 则是一种基质金属蛋白酶，由成骨细胞分泌。有研究发现MMP1水平与骨质疏松存在相关性[10]。朱伟等[11]发现MMP1可以促进成骨细胞的分化和改善骨质疏松。杨全增等[12]通过实验验证了MMPs 表达量的上调可以抑制骨基质和Ⅰ型胶原的过度降解，维持骨重建平衡。FOS 是一种核内磷酸蛋白，有研究证明其表达受RANKL 调控，当RANKL 与受体结合时，能够刺激C-FOS 的生成，整个过程能够刺激破骨细胞分化增加，影响骨吸收，导致骨质疏松[13]。Takayanagi H等[14]发现抑制C-FOS 的表达可以减少促炎因子生成，阻止炎症发生及进展，进而抑制破骨细胞活化，最终改善骨质疏松。

本研究通过GO 富集分析及KEGG 通路分析发现，肾阳虚型PMOP 与PI3K-Akt 信号通路、Th17 细胞分化、化学致癌受体激活、脂质与动脉粥样硬化、哮喘、类风湿性关节炎通路有关。其中PI3K-Akt、Th17 细胞分化信号通路通过多种方式参与信号传导，与骨质疏松关系密切[15，16]。现代研究发现[17]，PI3K-Akt 通路是参与炎症反应及骨代谢失衡的关键通路之一，激活PI3K-Akt 通路可引起成骨细胞凋亡、破骨细胞生成及骨吸收控制节点失衡，导致骨代谢异常及骨质疏松的发生。另有研究发现[18]，Th17细胞分化通路亦与骨质疏松存在联系。女性绝经后雌激素缺乏能够增强Th17 细胞分化功能，进而导致IL-17 分泌增多，而IL-17 能够增加来自成骨细胞的促破骨细胞因子来诱导骨丢失，加剧骨量的减少，最终导致PMOP 的发生。

本研究得到淫羊藿的23 种活性成分，对应467种治疗靶点。其中槲皮素、山柰酚、木犀草素可能作用于EGF、CRP、FOS、MMP1 发挥抗骨质疏松的作用。槲皮素、山柰酚、木犀草素均为黄酮类化合物，具有抗骨质疏松的作用。实验研究发现[19，20]，槲皮素能够促进BMSCs 增殖和成骨分化，抑制骨丢失，增加骨密度，改善骨质疏松。山柰酚可能通过下调c-Fos的表达减少破骨细胞的生成，治疗骨质疏松[21]。木犀草素可能通过激活PI3K-Akt 信号通路从而改善PMOP 大鼠的骨丢失[22]。本研究选取活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草与潜在治疗靶点EGF、CRP、FOS、MMP1 进行对接，结果显示，对接能量均低于-5 kJ/mol，可知药物的主要有效成分进入机体后能与潜在治疗靶蛋白有良好的亲和力，表明淫羊藿以多成分协同的形式作用于多个关键靶点，发挥治疗肾阳虚型PMOP 的作用。

综上所述，淫羊藿中的槲皮素、山柰酚、木犀草素可能通过EGF、CRP、FOS、MMP1 靶点与PI3KAKT、Th17 细胞分化通路治疗肾阳虚型PMOP。