芹菜素对Aβ1-42致阿尔茨海默病大鼠海马组织氧化应激和炎症反应的影响*

范红娟，康凯宁，栗志英

1.邯郸市中心医院，河北 邯郸 056000； 2.河北工程大学附属医院，河北 邯郸 056000

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是老年人群中较为常见的一种中枢神经系统退行性疾病，是老年痴呆的主要分型，其致死率仅次于心血管疾病、肿瘤、脑卒中，严重影响老年人生活质量和生命健康。AD主要表现为认知障碍、记忆力减退、人格及行为改变等[1]。海马组织是与认知、记忆等密切相关的脑功能区，研究发现，减轻海马神经元损伤能够有效改善AD症状并延缓其进展[2-3]。近年来病理学研究发现，β淀粉样蛋白(beta amyloid，Aβ)病理性沉积是AD最主要的病理改变，氧化应激和炎症反应在其病变过程中发挥着重要作用[4-5]。因此，探索以抑制氧化应激和炎症反应为治疗靶点的新型药物对改善AD具有重要意义。

AD在中医中又称为“老年呆病”，属于“健忘”“呆症”“文痴”等范畴，其病机在于脾胃虚弱、气血亏虚、痰浊血淤、阻塞清窍，为本虚标实之证[6-7]。芹菜具有养血补虚、清热解毒等功效，芹菜素是天然存在于旱芹等植物中的一种黄酮类化合物，具有良好的抗氧化、抗炎活性[8-9]。核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1(nuclear factor E2 related factor 2/heme oxygenase 1，Nrf2/HO-1)是氧化应激反应重要的信号通路[10]；核转录因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)对炎症反应具有重要调控作用[11]。研究发现，芹菜素可调控Nrf2/HO-1通路抑制氧化应激进而有效减轻妊娠期糖尿病大鼠肝损伤，调控NF-κB核转位抑制炎症反应进而有效抑制糖尿病肾损伤[12-13]。本实验旨在探讨芹菜素对β-淀粉样蛋白1～42片段(β-amyloid 1～42 fragments，Aβ1-42)致AD大鼠海马组织氧化应激和炎症反应的影响及相关机制。

1 材料

1.1 实验动物8周龄SPF级雄性Wistar大鼠100只，体质量220～250 g，购自河北医科大学实验动物公共服务平台，许可证号：SYXK(冀)2020-001，动物合格证号：20200925006。大鼠分笼饲养于室温23～25 ℃、相对湿度55%～65%的环境中，自由饮水进食，所有大鼠在实验过程中均按照3R原则给予人道主义关怀。本实验通过邯郸市中心医院伦理委员会审批，审批号：HDZXLL(K)2020-024。

1.2 药物与试剂芹菜素(陕西慧科植物开发有限公司，纯度≥98%，批号：191125)；吡拉西坦片(石药集团欧意药业有限公司，批号：1200413)。Aβ1-42冻干粉(美国Sigma公司，批号：119M8714V)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：200127、200319、200114、200407、191230、200319)；胞浆胞核蛋白制备试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司，批号：0918A20)；Nrf2抗体、HO-1抗体、NF-κB p65抗体(北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-1074R、bs-23397R、bs-3485R)；β-肌动蛋白(β-actin)抗体(美国Abclonal公司，批号：AC026)；IgG二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：180511)；增强型化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0018AS)。

1.3 仪器MD-3000型动物脑立体定位注射仪(美国BAS公司)；ZH-Morris型水迷宫及视频分析系统(安徽正华生物仪器设备有限公司)；RM2016型石蜡切片机(上海徕卡仪器有限公司)；BMJ-A型包埋机(常州中威电子仪器有限公司)；5424R型离心机(德国Eppendorf公司)；MK3 型酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；DYCZ-24DN型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；JY200C型转膜仪(北京君意东方电泳设备有限公司)；GelDoc XR型凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 动物分组、造模与给药适应性饲养1周后，按照随机数字表法，将100只大鼠随机分为5组，分别为正常组、模型组、芹菜素低剂量组、芹菜素高剂量组和吡拉西坦组，每组20只。除正常组外，其他组大鼠均参照文献[14]报道的方法复制AD大鼠模型，具体如下：以3 mL·kg-1体积腹腔注射10%水合氯醛溶液实施麻醉后，将大鼠固定于脑立体定位注射仪，于前囟后3.0 mm、正中矢状缝左旁和右旁3.0 mm、颅骨表面下3.5 mm处分别缓慢注射 2.5 μL 的Aβ1-42溶液(浓度4 g·L-1)，注射时间 10 min；正常组大鼠缓慢注射2.5 μL 9 g·L-1氯化钠溶液，注射时间10 min。造模完成后，芹菜素低剂量组、芹菜素高剂量组大鼠分别以20 mg·kg-1、40 mg·kg-1剂量腹腔注射芹菜素溶液[15]，吡拉西坦组大鼠以700 mg·kg-1剂量腹腔注射吡拉西坦溶液(根据人临床剂量换算)，正常组和模型组大鼠腹腔注射给予9 ng·L-1氯化钠溶液，注射体积均为5 mL·kg-1，每天1次，疗程28 d。

2.2 Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力将Morris水迷宫分为4个象限，平台固定于第4象限的中心位置，水温25 ℃。末次给药24 h后，各组随机取10只大鼠，适应性训练3 d，每天训练4次，分别从4个象限头朝器壁方向将大鼠放入水中并引导大鼠寻找第4象限的平台。定位航行实验：第4天将大鼠分别从4个象限头朝器壁方向放入水中，记录找到位于第4象限平台的时间(120 s内未找到则按120 s计算)，即为逃避潜伏期；空间探索实验：第5天撤掉位于第4象限的平台，将大鼠从第2象限头朝器壁方向放入水中，记录120 s内穿越第4象限原平台位置的次数。

2.3 HE染色观察海马组织CA1区神经元病理改变及病理分级Morris水迷宫实验完成后，麻醉、颈椎脱臼处死大鼠，取脑组织并去除小脑、脑干、嗅球后置于10%中性甲醛溶液中固定3 d，石蜡浸润包埋，5 μm厚连续切片，部分切片经梯度乙醇脱蜡水化后行常规HE染色，通过光学显微镜观察海马组织CA1区病理特点。参照文献[16]报道的方法对海马组织CA1区病理改变进行分级：神经元形态和结构正常为“-”；少量神经元形态改变为“+”；部分神经元胞核固缩或溶解、神经元排列疏松为“++”；大部分神经元胞核固缩或溶解、神经元层次紊乱为“+++”。

2.4 海马组织SOD、GSH-Px活性，MDA含量及TNF-α、IL-1β、IL-6水平检测分别取各组剩余的10只大鼠，麻醉后颈椎脱臼处死，冰上取脑组织并剥取海马体，取左侧海马组织，剪碎后加入6倍量4 ℃裂解液研磨匀浆，4 ℃、2 000 r·min-1离心 5 min，离心半径10 cm，取上清液，按照试剂盒说明检测SOD、GSH-Px活性，MDA含量和TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。

2.5 Western Blot检测海马组织Nrf2、HO-1、胞浆NF-κB p65、胞核NF-κB p65蛋白表达水平取右侧海马组织100 mg，按照胞浆胞核蛋白提取试剂盒操作说明制备胞浆胞核蛋白，BCA法测定总蛋白含量后经SDS-PAGE电泳分离蛋白，转聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，50 g·L-1脱脂奶粉封闭处理后，滴加Nrf2抗体(稀释比例1500)、HO-1抗体(稀释比例1500)、NF-κB p65(稀释比例1800)、β-actin抗体(稀释比例11 000)，4 ℃ 孵育过夜，滴加IgG二抗(稀释比例 12 000)室温孵育2 h，滴加ECL显影后通过Image J 软件计算蛋白条带灰度值，以目的蛋白条带与β-actin条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

3 结果

3.1 芹菜素对AD大鼠认知功能的影响与正常组比较，模型组大鼠逃避潜伏期显著延长(P<0.05)，穿越平台次数显著减少(P<0.05)；与模型组比较，芹菜素高剂量组和吡拉西坦组大鼠逃避潜伏期显著缩短(P<0.05)，穿越平台次数显著增多(P<0.05)；与吡拉西坦组比较，芹菜素高剂量组大鼠逃避潜伏期显著缩短(P<0.05)，穿越平台次数显著增多(P<0.05)。见表1。

3.2 芹菜素对AD大鼠海马组织CA1区神经元病理改变及病理分级的影响正常组大鼠海马组织CA1区神经元形态呈圆形或椭圆形，排列整齐，层次清晰。模型组大鼠海马组织CA1区神经元数量减少，形态不规则，排列紊乱，胞体固缩深染。与模型组比较，各给药组大鼠海马组织CA1区神经元病理学改变呈不同程度减轻，芹菜素高剂量组改善效果最为显著。与正常组比较，模型组病理分级显著升高(P<0.05)；与模型组比较，芹菜素高剂量组和吡拉西坦组病理分级显著降低(P<0.05)；与吡拉西坦组比较，芹菜素高剂量组病理分级显著降低(P<0.05)。见图1，表2。

表1 芹菜素对AD大鼠认知功能的影响

注：A：正常组；B：模型组；C：芹菜素低剂量组；D：芹菜素高剂量组：E：吡拉西坦组图1 芹菜素对AD大鼠海马组织CA1区神经元病理改变的影响(HE，×400)

表2 芹菜素对AD大鼠海马组织CA1区神经元病理分级的影响

3.3 芹菜素对AD大鼠海马组织SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响与正常组比较，模型组海马组织SOD、GSH-Px活性显著降低(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.05)；与模型组比较，芹菜素高剂量组和吡拉西坦组SOD、GSH-Px活性显著升高(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)；与吡拉西坦组比较，芹菜素高剂量组SOD、GSH-Px活性显著升高(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)。见表3。

3.4 芹菜素对AD大鼠海马组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响与正常组比较，模型组大鼠海马组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，芹菜素高剂量组和吡拉西坦组大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著降低(P<0.05)；与吡拉西坦组比较，芹菜素高剂量组 TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著降低(P<0.05)。见表4。

表3 芹菜素对AD大鼠海马组织SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响

表4 芹菜素对AD大鼠海马组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响

3.5 芹菜素对AD大鼠海马组织Nrf2、HO-1蛋白表达水平的影响与正常组比较，模型组大鼠海马组织Nrf2、HO-1蛋白表达量均显著降低(P<0.05)；与模型组比较，芹菜素高剂量组和吡拉西坦组Nrf2、HO-1蛋白表达量显著升高(P<0.05)；与吡拉西坦组比较，芹菜素高剂量组Nrf2、HO-1蛋白表达量显著升高(P<0.05)。见图2、表5。

注：A：正常组；B：模型组；C：芹菜素低剂量组；D：芹菜素高剂量组；E：吡拉西坦组图2 大鼠海马组织Nrf2、HO-1蛋白条带图

3.6 芹菜素对AD大鼠海马组织胞浆NF-κB p65、胞核NF-κB p65蛋白表达水平的影响与正常组比较，模型组海马组织胞核NF-κB p65蛋白表达量及胞核NF-κB p65、胞浆NF-κB p65蛋白表达量比值均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，芹菜素高剂量组和吡拉西坦组胞核NF-κB p65蛋白表达量及胞核NF-κB p65、胞浆NF-κB p65蛋白表达量比值均显著降低(P<0.05)；与吡拉西坦组比较，芹菜素高剂量组胞核NF-κB p65蛋白表达量及胞核NF-κB p65、胞浆NF-κB p65蛋白表达量比值均显著降低(P<0.05)。见图3，表6。

注：A：正常组；B：模型组；C：芹菜素低剂量组；D：芹菜素高剂量组；E：吡拉西坦组图3 大鼠海马组织胞浆NF-κB p65、胞核NF-κB p65蛋白条带图

表5 芹菜素对AD大鼠海马组织Nrf2、HO-1蛋白表达水平的影响

表6 芹菜素对AD大鼠海马组织胞浆、胞核中NF-κB p65蛋白表达水平及比值的影响

4 讨论

AD患病人群主要为65岁以上老年人，随着我国人口老龄化的加剧，AD发病率呈明显上升趋势，已成为我国亟待解决的社会问题和医学难题[17]。中医药具有防治结合、标本兼治的优势，在慢性病防治方面得到广泛关注与认可。芹菜为一年或二年生伞形科植物，其根、茎、叶、籽均可入药，具有养血补虚、清热解毒、防癌抗癌之功效，具有较高的药用价值。芹菜素为芹菜的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎等多种药理学作用，涂丰霞等[15]研究发现，芹菜素对脑缺血所致认知功能障碍具有明显改善作用。吡拉西坦是一种神经细胞保护剂，对AD所致认知障碍、思维功能减退等具有明显改善作用，常用做AD新型药物实验研究的阳性对照药物[18]。双侧海马定向注射Aβ1-42制备AD大鼠模型具有操作简单、重复率高、与人类AD病理特点近似等优势，是国内外普遍认可的造模方法。本研究发现，AD模型大鼠学习记忆能力下降，大脑海马组织CA1区呈现神经元数量减少、形态不规则、排列紊乱、胞体固缩深染等病变，与李喜香等[19]研究报道一致，经芹菜素治疗则能够明显提高AD大鼠学习记忆能力，改善海马组织CA1区病变、降低病理分级，并且芹菜素高剂量组效果优于吡拉西坦组，提示芹菜素能够减轻AD大鼠海马组织损伤，改善AD症状。

Li等[20]研究发现，Aβ病理性沉积可导致活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量生成，SOD、GSH-Px等抗氧化酶过度消耗，不能及时清除的ROS将攻击生物膜和生物大分子引发氧化应激损伤并诱发细胞凋亡。此外，Aβ病理性沉积将诱发炎症因子大量释放而引起炎症反应，其中具有趋化因子属性的TNF-α、IL-1β、IL-6能够刺激粒细胞等进一步释放炎症因子而加重炎症反应[21]。Nrf2普遍存在于真核细胞中，能够诱导SOD、GSH-Px等抗氧化酶表达而抑制氧化应激，并且Nrf2能够调控其下游基因HO-1的转录与表达，而HO-1则能够催化血红素分解成亚铁、一氧化碳、胆绿素，而胆绿素对ROS具有较强的还原活性，从而降低氧化应激损伤[22]。王珊等[23]研究发现，通过药物激活Nrf2/HO-1通路能够减轻Aβ致AD大鼠海马组织氧化应激损伤。NF-κB是一种以p50/p65二聚体形式存在的核转录因子，生理状态下与特异性酶抑制剂结合而无生理活性；病理状态下，ROS等将诱导 NF-κB 与酶抑制剂解离而使其活化，核转位后p65亚基与DNA特异性位点结合诱导炎性因子表达与释放，进而加重炎症反应[24]。HO-1则能够抑制NF-κB活化与核转位，从而间接抑制机体炎症反应[25]。王海英等[26]研究发现，通过药物抑制 NF-κB活化和核转位能够减轻AD所致炎症反应。本研究发现，经芹菜素治疗能够明显提高AD大鼠海马组织SOD、GSH-Px活性并降低MDA含量，降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平，提高Nrf2、HO-1蛋白表达量，降低胞核NF-κB p65蛋白表达量及胞核NF-κB p65、胞浆NF-κB p65蛋白表达量的比值，芹菜素高剂量组作用优于吡拉西坦组，提示芹菜素具有抑制AD大鼠海马组织氧化应激和炎症反应的作用，其机制可能与激活Nrf2/HO-1通路、抑制NF-κB核转位有关。

综上所述，芹菜素能够抑制Aβ1-42致AD大鼠海马组织氧化应激和炎症反应，改善AD症状，该作用可能与激活Nrf2/HO-1通路、抑制NF-κB核转位有关。本研究结果为芹菜素治疗AD提供参考，为AD药物开发提供理论依据。