牙周病中固有淋巴细胞的研究进展

成益凡 秦旭 姜鸣 朱光勋

华中科技大学同济医学院附属同济医院口腔科 武汉 430030

固有淋巴细胞（innate lymphoid cells，ILCs）是一群具有适应性免疫功能，但不表达T淋巴细胞或者B淋巴细胞抗原特异性受体的固有免疫细胞。ILCs来源于共同淋巴祖细胞（common lymphoid progenitor，CLP），CLP在DNA 结合抑制因子2（inhibitor of DNA binding 2，ID2）的调控下分化为共同固有淋巴祖细胞（common innate lymphoid progenitor，CILP），CILP继续向下游分化，形成自然杀伤祖细胞（natural killer cell progenitor，NKP）和共同辅助固有淋巴细胞前体（common helper innate lymphoid progenitor，CHILP），CHILP进一步分化为淋巴组织诱导细胞（lymphoid tissue-inducer，LTi）、调节性固有淋巴细胞（regulatory innate lymphoid cells，ILCregs）和固有淋巴细胞前体（ILC precursor，ILCP），最后ILCP和NKP在不同的转录因子调控下分化为ILC1、ILC2、ILC3、自然杀伤（natural killer，NK）细胞，并使得它们具有不同的功能[1-4]。ILCs多为组织驻留淋巴细胞，主要分布于肺、胃肠道组织等黏膜屏障部位[5]。ILCs在早期抵御病原体入侵中发挥关键作用，并且参与受损组织的修复，上皮屏障的维护和淋巴器官的形成，在肺、胃肠道组织中已经得到广泛研究[6-7]。牙周病是菌斑微生物和宿主免疫保护机制相互作用的结果，主要致病因素是通过调控宿主保护性或破坏性免疫反应促进牙周病的发生和发展[8]。有研究[9-10]表明：ILCs也存在于健康和炎症牙周组织（包括牙龈和牙周韧带）中，不同亚型ILCs主要通过调控牙周组织的骨代谢、免疫炎症反应以及组织修复方面参与牙周病的发生发展，进一步阐述和证明了牙周病和ILCs的相关性。本文就ILCs在牙周病中的研究进展进行综述。

1 ILCs的分类与功能特点

1.1 ILCs的分类

通常根据ILCs表达的转录因子、分泌的细胞因子和功能特点的不同，将其分为3型：Ⅰ型ILCs、Ⅱ型ILCs和Ⅲ型ILCs[6]。随着对ILCs分化和发育研究的不断深入，根据ILCs的表型特征和功能差异，可将其分为6个细胞亚群，即NK细胞、ILC1、ILC2、ILC3、LTi和ILCregs[4,6]。

ILC1s包括ILC1和NK细胞，后者根据细胞毒性可分为2个亚群：低细胞毒性CD56brightCD16-NK细胞和高细胞毒性的CD56lowNK细胞[11]。

ILC2s即ILC2，可以根据细胞因子受体表达模式的不同，分为2个细胞亚群：自然性ILC2s（natural ILC2s，nILC2s） 和炎症性ILC2s（inflammatory ILC2s，iILC2s）[12]。

ILC3s包括ILC3和LTi，而ILC3根据其是否表达自然细胞毒性受体（natural cytotoxicity receptor，NCR） 分为2类：NCR+ILC3s和NCR-ILC3s[5]。ILC3s根据其是否表达趋化因子受体6（chemokine receptor 6， CCR6） 分 为 2 类 ， 即 CCR6+ILC3s 和CCR6-ILC3s。 CCR6+ILC3s 即 为 LTi 细 胞 ， 而CCR6-ILC3s可以根据是否表达NKp46（NCR的一种，在人和小鼠中均表达）分为2类，即CCR6-NKp 46+ILC3s和CCR6-NKp46-ILC3s[13]。ILC3s根据其是否表达NKp44（NCR的一种，在人类中表达）还可以分为NKp44+ILC3s和NKp44-ILC3s[14]。

1.2 ILCs的功能特点

1.2.1 Ⅰ型ILCs Ⅰ型ILCs包括NK细胞和ILC1。NK细胞在发育过程中受转录因子T-bet和脱中胚蛋白（eomesodermin，Eomes）的调控，分泌穿孔素、颗粒酶、细胞因子干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ） 和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）[15]。NK细胞高表达穿孔素，有细胞溶解活性，可以直接杀伤靶细胞，还可以通过分泌细胞因子参与早期炎症反应，调节其他免疫细胞活性。NK细胞在抗病毒感染和抗肿瘤方面发挥重要作用[16]。ILC1发育过程中严格依赖于转录因子T-bet，分泌IFN-γ、TNF-α[17]。ILC1低表达穿孔素，没有或者有很弱的细胞溶解活性，主要参与机体抗寄生虫以及胞内细菌的感染[18]。

1.2.2 Ⅱ型ILCs Ⅱ型ILCs在生长发育过程中的关键调控因子为维甲酸相关孤儿受体α（retinoidrelated orphan receptor α，ROR α） 和GATA结合蛋白3 （GATA binding protein 3，GATA3）[19]。nILC2s聚集在健康组织中，表达肿瘤发生抑制因子2（suppressor of tumorigenicity 2，ST2），并低表达杀伤细胞凝集素样受体G1（killer cell lectin-like receptor G1，KLRG1）。iILC2s不表达表面分子ST2，在炎症感染的刺激下可高表达KLRG1和白细胞介素 （interleukin，IL） -25受体[12]。ILC2s在IL-25、IL-33（炎症刺激下，ILC2s可自分泌IL-33）及胸腺基质淋巴细胞生成素（thymicstromal lymphopoietin，TSLP）等刺激下分泌IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子，保护宿主免受多种微生物（如寄生虫、细菌、病毒）的侵害，并且通过产生双调蛋白（amphiregulin，AREG）参与损伤组织修复[20-21]。

1.2.3 Ⅲ型ILCs Ⅲ型ILCs包括ILC3和LTi。ILC3和LTi的发育过程中均依赖于转录因子RORγt[22]。ILC3在IL-1β和IL-23的刺激下分泌IL-17、IL-22等细胞因子，在宿主的慢性炎症、抗菌免疫和组织修复过程中发挥重要作用[23]。LTi也可分泌细胞因子IL-17、IL-22，在胎儿发育过程中即开始发挥作用，并且在淋巴结的形成和黏膜相关的淋巴组织的发育中有重要作用[24]。

1.2.4 ILCregs ILCregs是近年来发现的一种存在于人和鼠肠道中的ILCs新亚群。在ILCregs的发育过程中起关键作用的是ID3。ILCregs通过分泌IL-10抑制ILC1s和ILC3s活化以减轻二者引起的促炎反应；也可以通过自分泌转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β） 以维持和扩增ILCregs的数量[4]。

2 牙周组织中的ILCs及其在牙周病中的作用

2.1 牙周组织中的ILCs

已有研究[9,25-27]报道：各亚型ILCs均存在于健康和炎症牙周组织（包括牙龈和牙周韧带）中，但在健康和炎症牙周组织的分布存在差异，且差异有统计学意义。另外，健康牙周组织中富集的ILCs亚型主要为ILC1s[27]。在体内、外实验中均发现：炎症牙周组织的各型ILCs均增加，但其数量变化显著的ILCs类型仍有争议。笔者所在课题组的研究[9]证明：在小鼠牙周炎模型中，ILCs数量变化最明显的亚型是ILC2s。Li等[10]报道：ILC1s和ILC3s是人炎症牙周韧带富集的主要亚群，尤其是NKp44+ILC3s 亚群。虽然NKp44+ILC3s 仅占总ILC3s的5%，但与健康牙周韧带相比，炎症牙周韧带中NKp44+ILC3s数量明显增加。Kindstedt等[26]报道：在来源于人体牙龈炎和牙周炎的牙龈组织样本中，其富集的ILCs类型为ILC1s。在牙龈炎中发现ILCs各个亚型分布为ILC1s、ILC2s、NCR-ILC 3s和NCR+ILC3s占比分别为60%、7%、27%和6%；在牙周炎中发现ILCs各个亚型分布有所不同，ILC1s、ILC2s、NCR-ILC3s和NCR+ILC3s的占比分别为68%、9%、18%和4%。上述研究结果不一致可能与使用的样本不同有关。

2.2 ILCs在牙周病中的作用

2.2.1 Ⅰ型ILCs（NK 细胞和ILC1） NK细胞可能参与牙周组织的免疫炎症反应。有研究[28]报道了NK细胞在牙周炎中发挥促炎作用的机制，主要包括以下方面，即NK细胞通过细胞毒性反应、分泌趋化因子和细胞因子、调控B细胞和T细胞、上调自身免疫反应、与树突状细胞相互作用等，从而发挥促炎作用。还有研究[28-29]表明：NK细胞数量、表型与牙周状态之间存在相关性。在小鼠牙周炎模型和体外实验[29]中，均发现NK细胞和牙周病相关病原体具有相互作用，这可能增加IFN-γ和TNF-α的分泌，进而影响牙周病的发生发展。有研究[28]发现：NK细胞可能通过下调自身免疫调控B细胞、T细胞、树突状细胞的免疫反应，从而在牙周病中发挥免疫调节作用。NK细胞在牙周病中具体的免疫调节机制尚不清楚，还需进一步研究探讨[28]。

ILC1s可能参与牙周组织的免疫炎症反应和骨代谢。与野生型健康小鼠相比，野生型牙周炎小鼠牙周组织的ILC1s数量增加[9]。体外实验[10]中，与健康牙周韧带相比，炎症牙周韧带中ILC1s数量也同样增加。用豆蔻酰佛波醇乙酯（phorbol-2-myristate-13-acelale，PMA）/离子霉素刺激从健康和炎症牙周韧带分离出的ILC1s，发现在炎症牙周韧带来源的ILC1s中，IFN-γ的表达明显增加[10]。为了模拟激活ILCs的生理条件，用IL-12刺激从健康和炎症牙周韧带分离出的ILC1s，发现炎症牙周韧带来源的ILC1s分泌更多的IFN-γ[10]。研究[26]报道：在一小部分ILC1s上检测到核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL）的表达。RANRL在牙龈炎和牙周炎中表达的ILCs亚型主要是ILC1s。ILC1s有可能通过表达RANKL从而有助于破骨细胞的形成和骨吸收，但是其具体机制并不清楚，无法确定ILCs在牙周组织中发挥骨改建的作用在多大程度上与ILC1s表达RANKL有关[26]。

2.2.2 Ⅱ型ILCs（ILC2s） ILC2s可能参与牙周组织的免疫调节。笔者所在课题组的研究[9]表明：通过敲除小鼠腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）基因，可以明确AMPK基因可促进ILCs，尤其是ILC2s在小鼠牙周组织中的浸润，减少IL-5、IL-33以及IL-13mRNA的表达，从而调节牙周组织的免疫反应。该研究[9]还发现：野生型和AMPK敲除型健康小鼠牙周组织中ILCs各亚型比例相似。与相应两型的健康小鼠相比，野生型牙周炎小鼠和AMPK敲除型牙周炎小鼠牙周组织中ILCs均明显增加，其中数量变化最明显的ILCs亚型均为ILC2s。另外，与野生型牙周炎小鼠相比，AMPK敲除型牙周炎小鼠牙周组织中 总 ILCs 和 ILC2s 增 加 均 更 明 显[9]。 野 生 型 和AMPK敲除型健康小鼠牙周组织各细胞因子的表达相似。与相应两型健康小鼠相比，野生型牙周炎小鼠和AMPK敲除型牙周炎小鼠牙周组织中IL-33mRNA表达均显著增加。另外，与野生型牙周炎小鼠相比，AMPK敲除型牙周炎小鼠牙周组织中IL-33mRNA的表达增加更明显[9]。除此之外，与相应两型健康小鼠相比，野生型牙周炎小鼠牙周组织中IL-5mRNA和IL-13mRNA的表达几乎不变，而AMPK敲除型牙周炎小鼠牙周组织中IL-5 mRNA和IL-13 mRNA的表达增加[9]。与小鼠牙周炎模型和体外实验结果相似，ILCs及其细胞因子在人炎症牙周组织较健康牙周组织ILCs各亚型均增加，变化最明显的是ILC2s，IL-5mRNA和IL-33mRNA表达均增加[9]。

2.2.3 Ⅲ型 ILCs（ILC3 和 LTi） ILC3s在牙周病中可能发挥着双重作用。一方面，牙周韧带中ILC3s可以通过分泌细胞因子IL-17促进牙周韧带组织的局部免疫炎症反应。与野生型健康小鼠相比，野生型牙周炎小鼠牙周组织的ILC3s数量增加[9]。体外实验[10]中，与健康牙周韧带相比，炎症牙周韧带中ILC3s也同样增加。用PMA/离子霉素刺激从健康和炎症牙周韧带分离出的ILC3s，发现在炎症牙周韧带来源的ILC3s中，IL-17的表达显著增加。为了模拟激活ILCs的生理条件，用IL-23和IL-1β刺激从健康和炎症牙周韧带中分离出的ILC3s，发现在炎症牙周韧带来源的ILC3s中，IL-17的表达也同样显著增强[10]。另一方面，牙周组织中的ILC3s可能通过降低CCR6的表达从而抑制牙周炎症。与相应两型健康小鼠相比，野生型牙周炎小鼠和AMPK敲除型牙周炎小鼠牙周组织中ILC3s增加。研究[9]发现：没有使用IL-23和IL-1β刺激ILC3s时，与相应两型健康小鼠相比，野生型牙周炎小鼠和AMPK敲除型牙周炎小鼠牙周组织中CCR6的表达均降低；在IL-23和IL-1β的刺激下，与相应两型健康小鼠相比，野生型牙周炎小鼠和AMPK敲除型牙周炎小鼠牙周组织中CCR6的表达均降低得更加明显。ILC3s降低CCR6的表达可能反映了一种代偿机制，即通过降低IFN-γ和IL-17的分泌潜力，同时增加IL-22的分泌，可以起到抑制炎症反应的目的，但具体机制还需进一步研究[9]。

3 小结与展望

综合上述研究可以看出，各型ILCs均存在于健康和炎症牙周组织中，并且参与了牙周病发生发展的进程。总结来说，不同亚型ILCs在牙周病的炎症应答、牙周骨代谢、组织修复中发挥着不同的作用。1）Ⅰ型ILCs：NK细胞参与牙周组织的免疫炎症反应，还可能参与牙周组织的免疫调节；ILC1通过分泌IFN-γ参与牙周的免疫炎症反应，还可能通过表达RANKL参与牙周骨代谢。2）Ⅱ型ILCs：ILC2s通过分泌IL-5、IL-13、IL-33参与牙周组织的免疫调节。3）Ⅲ型ILCs：ILC3s发挥双重作用，可以通过分泌IL-17促进局部免疫炎症反应，还可能通过降低CCR6的表达抑制牙周炎症。这些作用机制揭示了ILCs在牙周病的治疗中具有潜在作用，有望成为牙周病新的治疗靶点。

通过调节ILCs的活性或者其产生的效应分子有助于慢性炎症性疾病的治疗。在炎症性肠病动物模型中，采用中和ILCs的方法（如抗CD90的单克隆抗体）能减轻肠道炎症[30]。在小鼠结肠炎模型中，黄芩素可以通过ILC3s中芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）/IL-22通路改善溃疡性结肠炎的症状[31]。然而，目前对于ILCs在牙周组织中的具体功能和分子机制尚未明确。一方面，ILCs的数量很少，选择性分离很困难，难以单纯研究ILCs的具体功能和分子机制。另一方面，现在还未发现ILCs各亚型的特异性标志，无法将这些特异性标志作为靶点而使治疗策略具有特异性。由此可见，ILCs在牙周组织中的具体分子机制以及特异性药物的开发还需进一步研究。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。