视网膜色素上皮细胞间紧密连接及其在AMD发病过程中的作用研究进展

王巧云, 解来青

0 引言

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)是一种视网膜的退行性疾病，病变主要累及黄斑区域，进而造成中心视野缺失和视力下降，是全球老年人群不可逆视力损伤的首要原因[1]。根据其典型的临床和病理特点，AMD可分为干性(非渗出型或萎缩型)AMD和湿性(渗出型或新生血管型)AMD。干性AMD主要表现为眼底散在分布的玻璃膜疣，并逐渐引起黄斑萎缩。湿性AMD主要表现为脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)，从而引发眼底出血、渗出，晚期亦可发展为萎缩病灶[2]。在AMD的发展进程中，血-视网膜内、外屏障均有不同程度损坏，其中血-视网膜外屏障(outer blood retinal barrier, oBRB)的破坏发生在疾病晚期[3]。oBRB主要由视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium cells, RPECs)、Bruch膜以及脉络膜毛细血管的内皮细胞构成，其中RPECs间的紧密连接(tight junction, TJ)是确保oBRB屏障功能的最主要部分。在结构上，紧密连接由三个部分组成：(1)整合跨膜蛋白，如闭合蛋白(Occludin)、密封蛋白(Claudin)和连接黏附分子(junctional adhesion molecule, JAM)；(2)外周锚定蛋白，如ZO蛋白家族紧密连接蛋白1(tight junction protein 1, ZO-1)；(3)紧密连接相关调控蛋白[4]。紧密连接蛋白的缺陷在AMD发病进程中发挥着至关重要的作用[5]。目前临床上对于干性AMD缺乏特效的治疗方法，对于湿性AMD主要是将抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)药物注射到玻璃体腔内，以减少CNV的生长和渗出[6]，但该方法存在需重复注射、并最终无法逆转黄斑区纤维化瘢痕结局的缺点。因此，本文将对紧密连接在oBRB功能的维持、紧密连接蛋白异常与oBRB的破坏在AMD发病过程中的作用等相关研究进行综述，以期为AMD治疗的研究提供新的思路。

1 紧密连接与oBRB

1.1紧密连接与紧密连接蛋白紧密连接属细胞间连接的一种，后者还包括黏附连接、缝隙连接和桥粒连接。上皮细胞间和内皮细胞间的连接复合体主要由紧密连接构成，紧密连接使相邻的两个或两个以上细胞的细胞膜紧密的连接起来，以便封闭细胞间隙，形成细胞膜内外屏障，如oBRB[7]。在功能上，紧密连接蛋白主要起连接作用，其在肌动蛋白纤维上，形成连接膜和细胞骨架之间的桥梁。紧密连接对溶质和水的扩散形成了屏障，这被称为屏障功能。此外其对基底外侧和顶端质膜之间细胞极性的维持也形成了屏障，这被称为栅栏功能[8]。在物质运输和信号传导方面，紧密连接也发挥了重要作用，以便调节细胞的生长、增殖和分化[9]。生理状态下，细胞间连接始终保持动态平衡。在连接成熟和稳定过程中，跨膜蛋白的细胞内分布也会发生变化。即使在质膜和细胞质之间形成稳定的接触并持续循环之后，连接仍处于动态平衡状态[10]。

1.2RPECs间紧密连接与oBRB 血-视网膜屏障(blood-retinal barrier, BRB)分为血-视网膜内屏障(inner blood-retinal barrier, iBRB)和oBRB[11-12]。iBRB由视网膜毛细血管内皮细胞及包裹内皮细胞的周细胞和Müller细胞构成，Müller细胞通过信号传递的方式感知视网膜微环境进而影响视网膜毛细血管内皮细胞的活动。oBRB由RPECs之间的紧密连接、Bruch膜以及脉络膜毛细血管的内皮细胞构成。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)位于光感受器(photoreceptor, PR)与Bruch膜之间，将感光的视网膜与能量供应的脉络膜毛细血管隔开。紧密连接连接相邻的RPECs，阻止血浆成分和有毒分子进入视网膜，并允许液体和溶质以一定的渗透梯度从脉络膜血管系统流向视网膜外层[13]。此外，RPE还具有维持散射光的吸收、旁分泌(如分泌VEGF)、视网膜下间隙平衡等重要生理功能。因此，RPE的主动转运和RPECs间的紧密连接共同维持诸如视网膜-脉络膜营养物质的过滤和运输、视网膜代谢废物的清理和排泄、以及参与对光感受器外段(photoreceptor outer segment, POS)的吞噬作用，进而维持PR的正常生理功能[14]。

1.3紧密连接蛋白与oBRB的关系

1.3.1ZO-1与oBRB的关系ZO蛋白属膜相关鸟苷酸激酶家族(membrane associated guanylate kinase, MAGUK)，包括ZO-1、ZO-2和ZO-3三个亚型。其中ZO-1是在上皮和内皮细胞中发现的第一个紧密连接蛋白[13]。ZO-1与一些紧密连接跨膜蛋白结合，并与肌动蛋白丝连接，从而维持细胞动力[15]。ZO-1/ZO-1-相关核酸结合蛋白(ZO-1-associated nucleic acid-binding protein, ZONAB)信号通路控制上皮细胞在G1/S期转变和分化[16]。Georgiadis等[17]研究表明，ZONAB的激活是RPECs中ZO-1表达缺失的主要原因。下调ZO-1后可观察到RPE单层分子膜的固缩和破裂、POS固有的规则排列变的紊乱，并伴有细胞外间隙的形成，进而造成RPE屏障功能的破坏。Farjood等[18]研究显示，在人RPE长期培养中，ZO-1定位于根尖和细胞间区域，VEGF主要表达于基底外侧，ZO-1的表达水平和VEGF的表达量成反比。在干性AMD的后期，RPECs的凋亡导致其细胞间紧密连接的丧失，ZO-1表达下调，VEGF表达升高，进而促进CNV的形成。在对干性AMD向湿性AMD转变的病理分析中发现，CNV始于干性AMD的外周边缘，这也间接证明RPECs间紧密连接的破坏在干性AMD向湿性AMD的转变中发挥了重要作用。

1.3.2Occludin与oBRB的关系Occludin属紧密连接相关的Marvel蛋白(TJ-associated Marvel protein, TAMP)家族，是最早发现的与紧密连接相关的跨膜蛋白，其具有四个跨膜结构域[19]。Occludin优先定位于双细胞紧密连接中，参与细胞黏附和调节细胞旁通透性。其C端与ZO-1和ZO-2相互作用，最后150个氨基酸与肌动蛋白丝相互作用。新近研究发现，Occludin的翻译后磷酸化状态影响其在紧密连接中的位置及其对细胞外通透性的调节功能[12]。Occludin的苏氨酸和丝氨酸磷酸化与紧密连接完整性保持一致，而Occludin的酪氨酸磷酸化会破坏ZO-1和Occludin的结合，进而增加细胞旁通透性。在生理状态下，Occludin主要通过与ZO-1的相互作用来维持正常的RPECs间紧密连接[20]。Zhang等[21]研究发现，在实验性糖尿病视网膜病变模型中，oBRB的严重损伤是大鼠视网膜水肿的主要因素。促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)通过下调低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)信号通路，进而上调RPECs中ZO-1和occludin的表达，维持oBRB的完整性。在AMD发病过程中也存在Occludin与ZO-1结合体的破坏，Jo等[5]研究提出，细胞内淀粉样蛋白-β通过活化B细胞的核因子κ轻链增强子(nuclear factor kappa light chain enhancer of activated B cells, NF-κB)的活化，破坏Occludin与ZO-1复合物的完整性，进而促进AMD的疾病进展。Fabian等[22]新近报道，采用高渗和氧化应激破坏Occludin与ZO-1的连接可使脉络膜微环境中VEGF表达上调，而采用对Occludin与ZO-1连接的保护剂垂体腺苷酸环化酶活化多肽(pituitary adenylate cyclase activated polypeptide, PACAP)后，脉络膜中VEGF的表达出现下调，进而实验组小鼠黄斑区CNV的形成得到了有效抑制。上述研究为Occludin蛋白保护剂应用于AMD等新生血管性眼病的治疗提供了新的启示。

1.3.3Claudin与oBRB的关系与Occludin相似，Claudin也有四个跨膜区域(两个胞外域和两个胞内域)，其通过C端结构域直接与ZO-1、ZO-2和ZO-3等外周蛋白相互作用。Claudin的第一个胞外区决定跨上皮细胞膜电阻(trans epithellal electric resistance, TEER)和胞外电荷选择性，从而维持细胞间的通透性[13]。上皮细胞间的紧密连接可维持溶质和水在上皮细胞间的跨上皮运动，即细胞旁渗透性。细胞旁渗透性有孔隙途径和渗漏途径两种途径，前者介导小离子和溶质运动，后者介导大溶质运动[19]。Claudin蛋白形成基本的细胞旁渗透性屏障，并通过孔隙途径介导小离子和溶质运动，对细胞旁选择性和通透性发挥着独特的功能。Claudin有多种分型，在不同物种和不同组织表型各异。其中Claudin-19在RPE中表达且含量丰富，是目前最主要的Claudin[23]。Wang等[24]近期研究表明，突变Claudin-19可影响RPE发育的各个阶段，并对视网膜分化存在重要影响。

1.3.4JAM与oBRB的关系JAM是免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily, IgSF)中CTX亚家族的成员，包括JAM-A、JAM-B、JAM-C和JAM4[25]。已知JAM可与诸多蛋白质相互作用，并通过靶向紧密连接相关的蛋白质来调节紧密连接的功能。JAM由一个跨膜区和一个包含两个Ig样基序的胞外区组成。C端结构域参与紧密连接支架蛋白的相互作用，这对维持紧密连接的正常功能尤为重要。JAM-A可与Occludin、ZO-1共定位，进而维持正常的紧密连接[13]。Jia等[26]研究表明，JAM-C在成年小鼠视网膜和脉络膜中大量表达，在体外培养的RPECs和PR细胞中亦有所表达。过氧化氢(H2O2)诱导的氧化应激可下调JAM-C的表达，扰乱其膜定位，进而影响oBRB的正常功能。JAM-C在视网膜毛细血管内皮细胞中过表达或敲除分别降低或增加胞质Ca2+浓度，进而影响JAM-C的动态易位，造成BRB的功能障碍。调节JAM-C活性对BRB功能障碍相关眼病的治疗具有潜在的治疗价值[27]。

2 紧密连接及oBRB破坏与AMD

AMD的相关研究提示，AMD的发生及进展与RPECs间紧密连接的破坏密切相关。在氧化应激、缺氧、炎症等病理条件下，RPE退化，视锥细胞凋亡，最终形成以黄斑区地图样萎缩为特征的干性AMD的晚期形态。在RPE的退化过程中，RPECs间紧密连接破坏(早于或晚于RPE退化，有待进一步研究)、紧密连接相关蛋白如ZO-1、Occludin、Claudin、JAM及VEGF的表达和分布发生异常，oBRB正常生理屏障功能遭到破坏，CNV形成并跨越RPE侵入神经上皮层下间隙，进而促进AMD由干性转变为湿性，局部微环境的改变会引起RPECs间紧密连接的进一步破坏，从而导致黄斑功能的严重损坏[3]。

RPECs的微绒毛从其顶面延伸至视杆细胞和视锥细胞的外节，从而构成RPECs和PR细胞之间独特的功能单元，这被认为是维持视觉功能的关键[28]。在干性AMD中，中央凹周围的RPE首先退化，随着病程进展，RPE退化逐渐向中央凹发展，最终导致中央凹视锥细胞凋亡和中心视力丧失。每个中央凹RPECs都支持其对应部位视锥细胞的营养代谢。最低限度的RPE再生，甚至维持现有的RPE而不进一步退化，可保证足够的PR存活，从而保证患者的中心视力和生活质量[29]。RPE变性、玻璃膜疣形成或与衰老相关的凋亡可导致RPECs间紧密连接的丢失，进而引起RPE的上述功能发生障碍[30]。在湿性AMD中，CNV形成是其主要病理机制，VEGF是CNV形成的始动因素。VEGF除脉络膜自分泌外[31]，亦可由健康RPECs的基底外侧分泌。生理条件下，适度VEGF的分泌参与脉络膜血管的调节[32]，而RPE退化引起的RPECs间的紧密连接破坏可诱导VEGF的过度表达，从而引发CNV，最终造成AMD由干性转变为湿性[33]。Warden等[34]通过对TEER和ZO-1的免疫荧光检测发现，100～500μmol/L浓度的甘氨胆酸和甘氨熊脱氧胆酸可有效保护RPECs间紧密连接免受氧化应激损伤，且可抑制VEGF介导的CNV形成及其迁移，为湿性AMD的治疗开辟了新的方向。上述研究表明，RPE破坏可引起紧密连接衰减或分布改变，进而通过VEGF上调改变AMD的进程[35]，而阻止或减缓RPECs间紧密连接的破坏，对阻止AMD的进展具有重要意义。

3 总结与展望

AMD引发的CNV部分由干性AMD期RPE的退化导致VEGF的过度表达所介导，探索oBRB屏障破坏的时期和机制对阻断VEGF过度表达有一定的指导意义。多种遗传因素、氧化应激、脂质代谢、炎症、外伤和衰老相关的凋亡等可造成黄斑部视网膜缺血缺氧，大量脂质代谢产物不能及时被清理从而形成以玻璃膜疣为特征的干性AMD的典型病理改变。当病情进展时，RPECs间紧密连接被破坏，VEGF过表达，CNV形成，CNV突破oBRB并向神经视网膜下间隙生长，从而使疾病进入到以黄斑区CNV形成和出血为特征的湿性AMD的更加严重的阶段。RPE相关紧密连接蛋白在湿性AMD的发病过程中的具体作用机制有待进一步深入的探讨。尽管已证实oBRB细胞间紧密连接缺陷与AMD引发的CNV有关，但紧密连接缺陷最初发生的时间点、始动因素及紧密连接相关蛋白改变的上、下游调控通路在AMD发生发展过程中的作用仍存诸多疑问。深入探究紧密连接缺陷与AMD的关系及其机制或许可为AMD相关新生血管性眼病的治疗提供新的思路。