免疫抑制治疗在脓毒血症治疗中的作用①

廖晓莹 吴 迪 吴明江 高艺恬 （温州大学生命与环境科学学院，温州 325000）

脓毒血症是一种高度异质性疾病，第三次脓毒血症国际共识定义（Sepsis 3.0）将脓毒血症定义为感染引起宿主反应失调导致的器官功能障碍，严重危害人类生命健康［1］。脓毒血症的高发病率和高病死率给全球健康问题带来了巨大威胁。全世界预计每年会出现4 890万例脓毒血症患者，其中1 100万人死亡，尤其是一些中低收入国家［2］。脓毒血症治疗后第1年，即使已出院的脓毒血症患者也会患有各种各样的长期后遗症且具有较高病死率，进一步表明了脓毒血症给医疗和社会带来的重大负担［3］。

脓毒血症是病原体入侵宿主引起的感染，脓毒血症住院患者免疫系统中存在“炎症风暴”和免疫抑制迹象，其程度因人而异［4］。免疫抑制会减弱机体对病原体或其他致病源的敏感性，进一步破坏宿主免疫系统并使机体偏离稳态。虽然许多脓毒血症患者在重症监护病房中接受治疗后得以存活，但由于免疫抑制，又发展为新的慢性危重疾病［5］。目前，抗脓毒血症药物研究多集中于研究脓毒血症患者初期炎症反应，多个抗脓毒血症相关药物临床试验反复失败，FDA也尚未批准用于治疗脓毒血症的药物。因此，在消除病原体引起的过度炎症反应同时，也能控制随之而来的免疫抑制反应可能是脓毒血症治疗药物开发的有效策略。

1 脓毒血症发病机制

1.1 脓毒血症期间持续性过度炎症反应 脓毒血症早期死亡通常表现为心血管衰竭和多种器官功能障碍，主要由过度炎症反应所致，因此早期抑制过度炎症反应是治疗脓毒血症有力的策略。机体过度炎症反应是由先天免疫系统介导的，宿主先天免疫系统通过先天免疫细胞（如树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和上皮细胞）的各种模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）识别病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），从而“感知”病原体，与此同时宿主也会释放损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）参与宿主免疫应激。通过识别PAMPs和DAMPs，先天免疫系统会清除病原性微生物从而保护机体，如果无法消除入侵病原体并导致其在体内大量繁殖，宿主可能发生持续性炎症激活甚至引发器官功能障碍［6］。脓毒血症发生与这种先天免疫系统强激活有关。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性菌外膜主要成分，自然界已知最有效的免疫刺激性化合物之一，过度激活先天免疫系统而作为脓毒血症的关键致病成分。最常见的PAMP激活即为LPS途径，LPS可结合位于细胞表面的Toll样受体（Tolllike receptor，TLR）等PRR被免疫系统识别［7］。白细胞分化抗原14（CD14）可通过糖基磷脂酰肌醇锚定于单核细胞、巨噬细胞及多形核白细胞表面，也有部分以游离形式存在于血液，这两种形式均能参与应对LPS血清依赖的细胞反应。CD14通过将LPS递呈给髓样分化蛋白-2（myeloid differential protein-2，MD-2）促使其与TLR4形成复合四聚体，进而激活膜内Toll/IL-1受体（TIR）招募其关键接头分子-髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88），从而触发促炎细胞因子释放和IFNs-Ⅰ产生［8］。因此，阻断或消除这些细胞因子可为急性感染模型动物提供保护作用［9］。尽管这些实验结果与人类脓毒血症的相关性有待进一步研究，但脓毒血症早期死亡可能主要由上述过度炎症反应导致。

1.2 脓毒血症期间免疫抑制

1.2.1 淋巴细胞的衰竭和凋亡 脓毒血症期间免疫抑制可归结为淋巴细胞减少和免疫功能丧失，且淋巴细胞衰竭和凋亡是脓毒血症免疫抑制的重要原因［10-11］。脓毒血症期间，抗原负荷高而促炎和抗炎细胞因子释放增多，是导致T细胞衰竭的重要原因。BOOMER等［12］测定了快速收集的40例脓毒血症死亡患者脾脏组织中细胞因子分泌和免疫细胞表面受体及其配体表达，确定了免疫抑制这种潜在机制，多角度证明了T细胞衰竭：①相比于对照组，受刺激的脓毒血症患者T细胞分泌的细胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-10）减少；②CD4+T细胞程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）和巨噬细胞PD-1配体（PD-ligand 1，PD-L1）表达增加；③T细胞CD127（IL-7受体α链）表达降低，是T细胞衰竭的另一表型。此外，该研究发现脓毒血症患者毛细血管内皮细胞和支气管上皮细胞PD-L1表达增加，已迁移到感染部位的T细胞功能受损，从而宿主根除致病微生物的能力严重受损［13］。另有研究表明，脓毒血症患者循环T细胞中PD-1表达升高与T细胞增殖能力下降、院内感染增加和病死率升高有关，为脓毒血症患者T细胞衰竭与脓毒血症发病和病死率存在潜在因果关系提供了依据［14］。动物研究表明抑制PD-1/PD-L1相互作用可提高一些脓毒血症临床相关模型存活率，与非脓毒血症患者相比，脓毒血症患者淋巴细胞PD-1高表达会减少IFN-γ和IL-2产生，因此阻断PD-1/PD-L1途径可作为脓毒血症治疗的重要靶点［15］。

1.2.2 抗原递呈细胞的代谢重编程 免疫抑制导致脓毒血症患者单核/巨噬细胞功能障碍的标志为受到LPS、其他TLR激动剂或细菌（或其他微生物，如真菌）再次刺激时，其释放促炎细胞因子的能力衰退，与脓毒血症中内毒素耐受现象一致。免疫抑制期间脓毒血症患者血液单核细胞HLA-DR表达降低，刺激后通常表现出较低的促炎细胞因子（如TNF-α、IL-1α、IL-6和IL-12）释放能力，而未削弱甚至增强了抗炎递质（如IL-1受体拮抗剂和IL-10）释放能力［16］。表明虽然LPS仍可激活单核/巨噬细胞，但细胞内信号转为产生抗炎分子。促炎和抗炎因子释放平衡一旦破坏，单核/巨噬细胞将发生代谢重编程［17］。由前期“炎症风暴”向后期免疫抑制转变的脓毒血症患者会改变其单核/巨噬细胞内糖酵解相关基因表达，致使免疫耐受期脓毒血症患者糖酵解和氧化代谢多重缺陷。目前，基因功能重编程已被认为是脓毒血症患者调节免疫细胞功能的重要机制，调控染色质基因位点转录活性或沉默状态。虽然常染色质转录活性可通过转录因子和聚合酶获得，但异染色质转录沉默很难获得，从而导致基因转录受抑制。细胞代谢重编程还受特异性 microRNA（miRNA）影响，通过miRNA进行转录后调控会靶向降解特定mRNA，致使其相关蛋白表达下调［18］。因此，表观遗传重塑可作为治疗免疫抑制的有效手段，主要通过调控免疫细胞基因转录状态发挥作用［19］。

2 脓毒血症治疗进展

2.1 TLR4通路抑制剂 细胞表面受体TLR4激活对LPS引起的脓毒血症和脓毒血症休克具有决定性影响，因此针对TLR4相关靶点蛋白研发设计了大量药物。GAO等［20］研究发现，总丹参酮通过阻断TLR4二聚化抑制MyD88-TAK1-NF-κB/MAPK信号级联反应在体内和体外发挥抗炎作用。KÖSE-VOGEL等［21］研究发现，低剂量蒽环类药物可在原代巨噬细胞中抑制NLRP3炎症体活化和细胞因子释放，进而减弱炎症性巨噬细胞反应。IPPAGUNTA等［22］研究发现，作为TLR特异性抑制剂的甲基哌啶吡唑（methyl-piperidino-pyrazole，MPP）可靶向MyD88的TIR结构域保护TLR4依赖性炎症小鼠。IC14是一种识别CD14的重组嵌合单克隆抗体（mAb），为确定其阻断CD14介导的细胞活化开展了一项关于IC14抗体治疗脓毒血症诱导的急性肺损伤患者的Ⅱ期临床试验（NCT00233207），但由于无法达到临床研究的有效注册人数，该研究于2007年终止，IC14治疗脓毒血症及其相关疾病的疗效研究也未被进一步阐明。起初一些用于治疗脓毒血症的药物虽然在细胞和动物实验上表现出了明显效果，甚至有些已用于临床前研究，但最终均以失败告终。Eritoran（一种合成的TLR4拮抗剂）可与LPS竞争性结合细胞表面TLR4/MD-2受体。一项调查Eritoran影响脓毒血症诱导死亡Ⅲ期临床试验（NCT00334828）结果表明，与接受安慰剂治疗相比，接受Eritoran治疗的严重脓毒血症患者28 d病死率并未降低。多黏菌素 B（polymyxin B，PMB）已被证明可降低脓毒血症患者血液内毒素水平。为研究PMB血液灌注降低循环内毒素水平是否会改善脓毒血症患者病死率，一项临床试验（NCT00629382）对其有效性进行了验证，但结果却显示与常规药物治疗中添加安慰剂相比，添加PMB血液灌注未降低严重脓毒血症患者28 d病死率。作为TLR4介导的信号传导的小分子抑制剂TAK-242也无法抑制脓毒血症休克或呼吸衰竭患者细胞炎症因子水平，与接受安慰剂治疗组患者相比，接受高剂量TAK-242治疗的部分脓毒血症休克和呼吸衰竭患者病死率并未降低。因此，TLR4抑制剂在临床试验中可能无法满足抗脓毒血症药物期望。一旦脓毒血症发生，TLR4抑制剂对脓毒血症治疗过于滞后，从而无法逆转该疾病发生。

2.2 靶向细胞凋亡的PD-1/PD-L1途径 PD-1和PD-L1表达增加在脓毒血症相关免疫抑制反应中起重要作用，SHINDO等［23］研究表明，真菌性脓毒血症模型中，PD-L1的抑制性抗体——新型短肽（Anti-PD-L1 peptide）可阻断PD-1与PD-L1相互作用，逆转T细胞功能障碍，提高脓毒血症患者生存率。HUANG等［24］研究发现，作为免疫抑制剂的霉酚酸酯（mycophenolate mofetil，MMF）通过抑制细胞因子释放和PD-1表达保护脓毒血症小鼠。一份关于传统疗法治疗真菌性脓毒血症妇女无效的病例报告表明，Nivolumab（抗PD-1抗体）和IFN-γ联用可恢复免疫功能并清除侵袭性感染，且Nivolumab和IFN-γ联合治疗在慢性丙型肝炎病毒感染患者中已表现出显著活性［25］。

2.3 炎症因子mRNA表达抑制 miRNA是基因表达的关键转录后调节因子，可控制约30%哺乳动物所有蛋白编码基因活性，已证明其参与了几乎每个细胞过程调控［18］。此外，miRNA通过干扰其驱动的互补基因实现对mRNA的转录后调控，从而定向降解特定mRNA并下调相关蛋白表达。ZHEN等［26］研究表明，脓毒血症小鼠体内miR-9基因表达增加，而敲低miR-9则部分逆转了脓毒血症小鼠IL-6和TNF-α上调，并延长了脓毒血症小鼠生存期。KANG等结合转录组学和表观基因组学方法发现，IFN-γ通过抑制TLR4介导的基因激活选择性消除LPS诱导的反馈并影响巨噬细胞活化［27］。ROSSATO等［28］研究表明，IL-10诱导的miR-187直接靶向TNF-α mRNA稳定性和翻译，并通过下调IκBζ（间接调节这两种细胞因子转录的主要调控因子）间接降低IL-6和IL-12p40表达，证明miR-187在IL-10驱动的抗炎反应生理调节具有核心作用。IL-10持续释放可能有助于增强脓毒血症诱导的免疫抑制，阻断IL-10则可逆转脓毒血症相关动物模型中脓毒血症诱导的免疫抑制并提高生存率［29］。IL-10高表达也与单核细胞人白细胞抗原-DR（human leukocyte antigen DR，HLA-DR）低表达相关，且单核细胞HLA-DR表达降低是脓毒血症诱导的免疫抑制研究最多的生物标志物。与mHLA-DR表达迅速增加患者相比，mHLA-DR表达延迟或未改善/下降患者发生不良事件风险更高，但其与mHLA-DR表达动力学无关，因此HLA-DR可作为治疗脓毒血症免疫抑制的有效靶点［30］。SRISAWAT等［31］研究发现，重症脓毒血症患者中接受PMB血液灌流增加了mHLA-DR表达并改善了预后，表明其在mHLA-DR低表达患者中具有潜在益处。孟强等［32］研究发现，血液滤过治疗通过上调患者血浆HLA-DR表达显著减少血浆中抗炎细胞因子IL-10表达，改善预后并减轻患者危重程度。

3 总结与展望

脓毒血症发病机制十分复杂，目前治疗仍存在很多困难与挑战，了解脓毒血症发生发展及预后的全过程，在发病不同阶段给予精确诊断和治疗显得尤为重要。如今市面上的抗菌药在治疗脓毒血症早期感染中具有不可或缺的地位，但对感染后期引起的免疫抑制毫无作用，甚至很多出院患者仍长期伴有各种后遗症，包括认知和身体障碍及心血管疾病，病死率也存在提高风险，进一步强调了脓毒血症对卫生保健和社会的影响。全面掌握脓毒血症发病机制对其治疗的精准把控至关重要。不仅需要在感染前期清除炎症诱发物并抑制机体持续炎症反应，还需要对后期机体发生的免疫抑制进行免疫治疗，尤其是机体出现严重免疫衰竭的患者。