黄酮类中药干预程序性细胞死亡在缓解脑缺血再灌注损伤中的研究进展

余松祚

（贵港市人民医院神经外科，广西 贵港 537100）

中风（stroke）是世界范围内第二大死因，也是导致寰球人类死亡及伤残的主要缘由之一。发展中国家的发病率不断升高，其中大多数中风是由于血液凝块滞留在大脑的一条动脉上，造成大脑动脉阻塞引起的缺血性中风[1，2]。缺血性中风目前最有效的治疗手段是早期溶栓治疗和经皮血管内介入治疗。然而，尽管再灌注恢复氧气供应具有有益效果，但快速再灌注对脑功能依然造成有害影响，也会加重神经细胞的损伤，显著恶化中风的功能结果，即脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）[3]。越来越多的实验证据表明[4-6]，CIRI 涉及一个动态复杂的病理生理过程，包括：能量代谢障碍、钙超载、线粒体功能障碍、兴奋性氨基酸毒性、氧化应激损伤、免疫炎症、硝化应激损伤、自噬和细胞焦亡等，且其致残率和死亡率高。因此，亟待发现预防及治疗CIRI的新药物。

中药用于治疗缺血性脑卒的历史悠长，可通过多种途径、多个作用靶点改善神经功能缺损发挥神经保护作用；另外，中药所含的多种活性成分可从多靶点阻断CIRI 的级联反应[7]。随着高通量筛选技术的快速发展，具有多靶点药理活性的天然产物作为潜在的新药引起了公众的关注，特别是黄酮类中药具有突出的药理作用。黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、异黄酮类、黄烷酮类等黄酮类中药均对血管内皮细胞有不同程度的保护作用。此外，黄酮类中药具有多种生物活性物质属于多元酚物质，有抑制神经元凋亡、抑制铁死亡、增强抗氧化酶活性、免疫调节以及抗氧化损伤等效果[8-10]。程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）从根本上来说是所有细胞活动中不可或缺的过程，包括细胞发育、伤口愈合和肿瘤的免疫监视等。迄今为止，已经发现了多个PCD 过程，包括细胞凋亡和非凋亡形式的细胞死亡（铁死亡、自噬、细胞焦亡、坏死性凋亡），在后生动物体内维持平衡中起着至关重要的作用[11]。现将黄酮类中药干预CIRI 程序性细胞死亡作用机制进行综述，以期为进一步开发黄酮类中药的潜在治疗价值提供参考。

1 黄酮类中药干预铁死亡对CIRI 的防治

铁死亡是一种新进发现的热门新型PCD，其特征是过度依赖铁的脂质过氧化，已被证明与多种人类疾病有关，最显著的是组织缺血再灌注损伤、神经变性和癌症等[12]。缺血再灌注是一种病理过程，发生在许多器官和疾病中，可导致细胞损伤和死亡。大脑是最容易迸发缺血再灌注的器官之一，脑水肿和脑坏死是CIRI 的主要表现[13]。大脑特别容易受到富含多不饱和脂肪酸和铁的脂质过氧化损伤，因为铁主要以二价铁和三价铁形式存在，氧化还原活性和这两种状态之间的循环导致通过芬顿反应产生活性氧。在缺血脑组织中，再灌注后活性氧升高，抗氧化系统的防御能力减弱，可诱导铁死亡并导致神经退行性疾病中的神经元死亡[14]。

与铁死亡相关的机制很复杂，主要包括3 个因素：铁、氨基酸和脂质代谢。谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）是铁死亡的关键调节因子，在将脂质过氧化氢转化为无毒脂质中起着至关重要的作用。此外，谷胱甘肽是GPX4 的重要辅助因子，GPX4 的失活或谷胱甘肽的消耗会导致脂质氢过氧化物的积累，最终诱导铁死亡。

山奈酚是一种主要的生物类黄酮，存在于许多蔬菜、水果和药用植物中。有研究发现[15]，山奈酚部分通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4 信号通路抑制铁死亡，从而保护神经元。高良姜素也是一种黄酮类化合物，主要从中草药中提取。高良姜素通过激活SLC7A11/GPX4 轴抑制铁死亡，并对CIRI 后沙鼠的海马神经元具有保护作用[9]。

红花黄色素是一种从红花中提取的类黄酮化合物，Guo H 等[16]使用脑动脉闭塞模型大鼠研究了红花黄色素对缺血性中风的预防作用，结果表明经过2 周红花黄色素的治疗减弱了神经功能缺损评分、脑含水量和梗塞面积。此外，红花黄色素还抑制了Fe2+和活性氧物质的积累，并逆转酰基辅酶A 合成酶长链家族成员4、转铁蛋白受体1、GPX4 和铁蛋白重链1 蛋白在大脑中的表达水平。血清中谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和丙二醛的水平也被红花黄色素处理逆转。相关研究说明类黄酮化合物红花黄色素可以通过减轻大鼠炎症和铁死亡而改善脑缺血再灌注损伤。

另外，Guan X 等[17]发现天然产物香芹酚可以通过降低缺血性沙鼠脑组织中脂质过氧化物的水平，增加GPX4 的表达来抑制铁死亡，从而对暴露于缺血/再灌注的沙鼠的认知功能障碍发挥保护作用，但香芹酚的血脑渗透性以及脂质过氧化介导铁死亡的具体机制尚不清楚。

综上所述，目前山奈酚、高良姜素、红花黄色及香芹酚等黄酮类中药干预铁死亡防治CIRI 涉及的机制主要是通过上调GPX4 水平和抑制脂质过氧化。此外，有研究发现[18]，黄芩素/黄芩苷在生理条件下是一种强铁螯合剂，但是目前的研究仅仅只报道了黄芩苷可通过抑制脂质过氧化，减少铁过载，抑制细胞铁死亡改善脑出血，尚无研究证实黄芩苷是否可以通过螯合铁减少铁过载来改善CIRI。

2 黄酮类中药干预自噬

黄酮类中药干预自噬对CIRI 的防治细胞自噬是细胞内溶酶体降解受损细胞器和大分子的过程，属于PCD，在细胞存活、分化和发育中发挥重要的稳态作用，以维持体内平衡。自噬主要有3 个关键蛋白：LC3、Beclin1 和p62。p62 和LC3 共同融合分解自噬来维持稳态，Beclin1 是PI3K/Akt/mTOR 自噬通路蛋白，可促进LC3Ⅱ诱导自噬。细胞自噬与细胞凋亡往往同时发生在组织损伤性疾病中，细胞自噬与脑缺血再灌注后继发性脑组织损伤关系密切[19]。进一步来说，在再灌注早期，自噬可以通过清除受损的细胞器和蛋白质起到保护作用；但在再灌注后期，过度自噬导致自噬细胞死亡，导致随后的细胞和组织损伤。因此，通过调节自噬以防治CIRI 是一个潜在的新疗法[20]。

近年来，越来越多的中药被证明具有调节脑神经元自噬水平，减轻CIRI 的作用。松柏素是蜂胶中含量最高的天然黄酮类化合物，Tao J 等[21]将松柏素单独或与自噬诱导剂雷帕霉素联合给予CIRI 大鼠，结果显示松柏素可以显著减轻CIRI 大鼠海马CA1锥体神经元的损伤。此外，松柏素不仅降低了CIRI大鼠海马CA1 中LC3II 和Beclin1 的表达并增加了p62 的水平，还减少了CIRI 大鼠自噬诱导剂雷帕霉素诱导的神经元损伤和自噬的过度激活。可见，黄酮类中药松柏素可通过抑制自噬改善CIRI。同样，Yang S 等[22]的研究也发现，黄酮类中药黄芩素可增加Bcl-2/Bax 比率，并降低caspase-3 表达，以减少神经元凋亡和改善神经元丢失。

此外，黄芩素还降低了LC3-II/LC3-I 比率并促进了PI3K/Akt/mTOR 信号通路的磷酸化，这意味着黄芩素也可以通过抑制自噬来改善CIRI。Feng J 等[23]也发现一种双氢黄酮类化合物柚皮苷拥有强大的清除过氧亚硝酸盐能力并抑制CIRI 条件下超氧化物和一氧化氮的产生。此外，柚皮苷减少了3-硝基酪氨酸的形成，降低了线粒体部分中LC3-II 与LC3-I 的比例，提示柚皮苷可通过抑制过氧亚硝酸盐介导的线粒体自噬激活减轻脑缺血再灌注损伤。

3 黄酮类中药干预细胞焦亡

细胞焦亡是一种受调节的细胞死亡的促炎形式，是近年来发现的新PCD。细胞焦亡主要分为依赖caspase-1 的经典途径和依赖caspase-4/5/11 的非经典途径两种[24,25]。在经典途径中，炎症小体可以通过模式识别受体识别病原体相关分子模式、危险相关分子模式以及改变稳态的分子过程。之后模式识别受体被激活并招募半胱天冬酶募集结构域，进一步促进模式识别受体与caspase-1 前体结合，形成成熟的caspase-1，接着激活炎症小体和Gasdermin D 促进IL-1β 和IL-18 的释放，导致细胞肿胀和破裂，最终导致细胞焦亡。而在非经典途径中则是通过脂多糖直接与caspase-11/4/5 结合并激活，然后裂解Gasdermin D，诱导膜孔形成，最终触发激活NLRP3 炎症小体[26]。

细胞焦亡与许多疾病如心脑血管疾病、肿瘤和缺血再灌注损伤的发生和发展密切相关。在中枢神经系统中，急性CIRI 可引发神经炎症，从而激活先天免疫反应和一系列炎症级联反应。而NLRP3 炎症小体参与炎症级联反应的调节，可同时导致CIRI 中Gasdermin D 执行细胞焦亡[27]。目前关于黄酮类中药通过干预焦亡以改善CIRI 的研究比较鲜见，只有Huang L 等[28]采用胎鼠大脑皮层神经元氧-葡萄糖剥夺模型和大鼠大脑中动脉闭塞模型分别在体外和体内模拟脑缺血再灌注损伤，研究结果表明姜黄素对神经元增殖有促进作用，对神经元细胞焦亡有抑制作用。其作用机制可能是通过抑制p38 MAPK 通路有效抑制NLRP1依赖性神经元焦亡，从而对脑缺血再灌注损伤发挥神经保护作用。

黄酮类中药具有多种生物活性，包括抗炎抗氧化等，并且在许多研究中已经发现黄酮类中药，如高良姜素[29]、二氢杨梅素[30]、异甘草苷[31]、黄芩素[32]等可通过不同机制干预焦亡以改善各类疾病，所以进一步研究黄酮类中药通过干预焦亡以改善CIRI也不免为另一种策略。

4 黄酮类中药干预坏死性凋亡

坏死性凋亡，也称为调节性坏死或者程序性坏死，由特定死亡受体检测到的细胞外或细胞内微环境扰动引发，是一种不同于凋亡和坏死的新型细胞死亡形式。近年来，不少研究发现CIRI 中存在坏死性凋亡[33-36]。坏死性凋亡的机制是由炎症受体的激活引发的，包括肿瘤坏死因子、TOLL 样受体和FAS配体。这些信号激活受体相互作用蛋白激酶（RIPK）1、3 和混合谱系激酶结构域样假激酶（MLKL）以引发坏死性凋亡[37]。女贞苷是一种黄酮类中药，具有抗炎和补体抑制作用。有研究发现[38，39]，女贞苷通过靶向RIPK1/RIPK3/MLKL 通路减少CIRI 大鼠脑的坏死性凋亡，从而保护大鼠脑免受缺血再灌注损伤。另外，研究报道称，柚皮油对CIRI 具有神经保护作用，可能是通过调节肿瘤坏死因子诱导的坏死性凋亡实现的[40，41]。

5 总结与展望

CIRI 是一个复杂且多环节的病理生理过程。心肺复苏患者功能丧失和死亡最重要的原因就是CIRI 引起的神经功能丧失。而中医药作为我国独特的瑰宝，在治疗疾病方面具有多通路、多靶点、毒副作用小且经济成本低等优势，尤其是黄酮类中药。黄酮类中药由一类来自药用植物的次生代谢物组成，具有许多药理活性，包括心脏保护、神经保护和抗炎等。大量证据表明，黄酮类中药在体外和体内缺血模型中均具有强大的神经保护特性。黄酮类中药通过启动各种潜在的信号通路，干预PCD，对中枢神经系统缺血后损伤发挥抑制铁死亡、自噬、细胞焦亡和坏死性凋亡作用，从而改善CIRI。从目前的研究来看，黄酮类中药通干预细胞焦亡和坏死性的凋亡来改善CIRI 方面的作用机制研究还比较缺乏。因此，未来的研究可聚焦于这一方向，以期为CIRI患者提供新的治疗方法。