青枯病对植物的为害及其生物防治研究

唐艺玮

（四川大学生命科学学院，四川 成都 610000）

茄科雷尔氏菌又名青枯菌，是一种土壤传播的细菌病原体，是世界上许多作物生产的主要限制因素。该菌是马铃薯褐腐病，番茄、烟草、茄子的细菌性枯萎病或南方枯萎病的致病因子。整个物种的宿主范围很广，但物种内不同的致病种会根据宿主的偏好发生。通常病原菌会侵染包括44 科在内的数百种植物，以及茄科中具有重要经济价值的寄主植物[1]。

由于茄科雷尔氏菌的众多致病性决定因素、广泛的宿主范围和强大的生存能力，使得控制青枯病变得困难，特别是应用化学品和物理治疗。铜化合物和其他农用化学品的应用对环境有很大的影响，并且通常与细菌耐药性的出现，甚至与可行但不可以培养的状态有关。因此世界上很多国家开始实施了许多生物防治的方法，而这些防治策略具有环境友好的优点。现有的生物防治方法主要是利用拮抗微生物以及噬菌体两种途径。

1 青枯病的危害性

青枯病有马铃薯褐腐病、喷雾剂眼病、烟草格兰维尔青枯病、香蕉莫科病和其他描述性名称。据统计，受青枯病影响的植物包括但不限于以下作物，例如，主要作物马铃薯、水果作物如香蕉和西红柿、油料作物向日葵和花生、香料作物、饲料、花卉、铁木和桉树以及许多观赏性的植物。其可以感染50 多个科的450 多个作物的物种。青枯菌可在植物次生根的根端和腋部等渗出部位定植。随后在细胞间感染内皮层和维管薄壁组织，然后侵入原生木质部血管，最终导致细胞壁的降解。青枯菌是植物致病菌中第二大破坏性病原菌，会导致严重的经济后果。Elphinstone 在2005 年报告青枯病造成的年度损失估计为10 亿美元。在青枯菌物种复合体中的细菌与新的寄主联系在一起，在世界范围内对农业生产造成严重威胁。此外，由于青枯病的防治价值高，危害性大，在发达国家农业经济中的货币损失是非常大的，仅美国土豆和番茄产业的价值分别为37 亿美元和16.7 亿美元。而且这种病原体很容易通过灌溉用水、农具和作物碎片传播，对发展中国家的自给农业也会构成严重威胁。

青枯病的病害症状表现为整个植物突然枯萎，一般茎横截面会出现黏液状的细菌渗出液，香蕉莫科病和马铃薯褐腐病在香蕉果实和马铃薯块茎上还会出现明显的细菌定植[2]。

2 青枯菌的多样性

作为一种高度多样化的病原体，青枯病病原菌被认为是一个物种综合体（RSSC），数百种基因上有截然不同的茄科雷尔氏菌。历史上，物种复合体被松散地根据寄主范围划分为种，根据从碳水化合物中产生酸的能力划分为生物变种。

随着分子工具的发展，近10 年来茄科雷尔氏菌的分类发生了很大的变化。2005 年，Fegan＆Prior 在分析了ITS（internal transcription spacer）区域、超敏反应、致病机理B（hrpB）和内切葡聚糖酶（endoglucanase,egl）基因序列的基础上，提出了一种新的分级分类。分析从世界各地分离到的140 株茄科雷氏菌菌株，发现该菌株可细分为4 个系统类型。这与菌株的地理来源有关，来自亚洲的菌株处于系统型Ⅰ，来自美洲的菌株处于系统型Ⅱ，来自非洲的菌株处于系统型Ⅲ，来自印度尼西亚、澳大利亚和日本的菌株处于系统型Ⅳ。而地理隔离和非寄主偏好是青茄菌株分离为4 种系统类型的主要驱动因素。系统类型本身还可以进一步细分为菌株组，称为sequevars 或序列变异。到目前为止，已经确定了50 多个sequevar。研究发现，新的RSSC 宿主的不断出现与不断扩大的系统型I 物种群有关，茄科雷氏菌具有长距离迁移和高重组潜力。此外，RSSC 还能通过其宿主特异性被分为5 个生理小种（Physiological Race），以及对6 种碳源（乳糖、麦芽糖和纤维二糖、甜醇、甘露醇和山梨醇）的利用能力被分成5 个不同的生化型（Biovar）：I、II、III、IV 和V[3]。

3 青枯菌的病原性因素

研究证明，青枯病菌主要致病性决定因素是Ⅲ型分泌系统（T3SS），此系统是一种注射器状的膜附录，将所谓的“效应蛋白”（Ⅲ型效应蛋白，简称为T3E）注射到植物细胞胞浆中以促进感染。Boucher 等（1992）发现任何大于20 hrp 或hrp 保守基因（hrc，编码该分子注射器的结构蛋白或调节蛋白）缺陷的突变都是非致病性的。胞外多糖（EPS）是一种松散的黏液，含异质组成，它在青枯菌的致病性中也起着重要作用。EPS 具备助于木质部血管闭塞的强大功效，最终会导致植物萎蔫症状。此外，Denny＆Baek（1991）发现EPS 在植物定植中也起重要作用。除这两种主要的毒力决定因素以外，青枯菌还会产生一系列的其他因素，也有助于结肠化合症状的出现。其中包括Ⅱ型分泌的植物细胞壁降解酶、运动性或附着附体、趋氧转导器、纤维素酶和果胶酶。如Kang 等（2001）研究证明参与抽搐运动、生物膜形成和根系附着的Ⅳ型菌毛，以及负责游泳运动的鞭毛有助于青枯菌对番茄的毒性。此外，运动和附着似乎在植物入侵过程中也发挥作用，这是由于大多数受这些能力影响的突变体在土壤中接种时是低致病性的，但在植物茎中直接接种时表现与野生型菌株一样。最近Wairuri 等人的报告表明，Flp 菌毛引起的聚集也在青枯菌的致病性中起作用，因为这些菌毛缺乏的突变体会表现出野生型的游泳或抽搐运动，但它会导致马铃薯植株萎蔫的能力下降[4]。

4 青枯菌毒力基因的调控

已有研究发现控制青枯菌的主要毒力基因转录途径。LysR 家族的转录调控因子PhcA 发挥着核心作用。PhcA 激活EPS 和纤维素酶编码基因，抑制游泳运动、T3SS 和铁载体表达。PhcA 通过PehR 抑制一个果胶酶编码基因的转录，尽管其也稍微激活其他果胶酶基因的表达。此外，全局调控因子PhcA 的转录受青枯菌特异性细胞密度依赖机制的控制，包括内膜蛋白PhcB 产生的3-羟基棕榈酸甲酯（3-OH PAME）。在低细胞密度时，PhcA 的表达被PhcR 通过转录后机制抑制。当3-羟基棕榈酸甲酯的数量由于限制或细菌密度超过107 个细胞／mL 而增加时，分子激活了PhcS／PhcR双组分系统。然后，PhcR 被磷酸化，PhcA 表达被去抑制。在高细胞密度条件下，PhcA 活化的主要结果之一是产生大量EPS。这种控制作用通过诱导XpsR 发挥作用，XpsR 直接激活EPS 操纵子的转录。已有研究表明，双组分调控系统VsrA／VsrD 也需要完全激活xpsR 转录，进而激活EPS 合成。另一种双组分体系VsrB／VsrC也被描述为控制EPS 合成和抑制果胶酶pglA 的转录，增加对EPS 合成的另一层控制。因此，XpsR 是EPS 调控的中心开关，其整合了VsrAD＆PhcA 的输入，直接调控EPS 启动因子，是EpsR 阴性调控和VsrC 阳性调控所必需的。T3SS 的调控证明，在进化过程中，水平转移的操纵因子可以协同受体细菌中的转录调控因子，在青枯菌中，AraC-型调控因子HrpB 及其上游OmpR-样双组分响应调控因子HrpG 控制hrp／hrc 基因的表达。HrpB 直接触发T3SS 基因的转录，可能会与启动因子区域发现的hrpII 核子结合，其表达受HrpG 控制。当细菌检测到植物细胞壁成分时，会触发HrpG 特异性诱导的上游调控因子，这是青枯菌所特有的。PrhA是感知这一信号的外膜受体，并通过连续诱导的转录调控因子PrhJ、HrpG＆HrpB，将其转移到膜相关蛋白PrhI＆PrhR，从而触发hrp／hrc 的表达[5]。

5 青枯病的生物防治

目前青枯病生物防治主要集中在拮抗微生物（一般包括病原体和其他细菌物种菌株的无毒突变体）以及噬菌体的使用上。下面讨论青枯病通过青枯菌的拮抗菌和噬菌体两种途径的生物防治。

5.1 青枯菌拮抗菌的生物防治

植物根际促生长细菌（PGPR）是存在于植物根际的一类兼有促生和生防功效的根际自生细菌。Maji＆Chakrabartty（2014）研究发现，PGPR 与植物根系以及根际其他微生物会相互作用，具有潜在的青枯病抑制作用，使病原微生物水平处于控制或低于阈限。因此，PGPR 被认为可以促进植物生长并控制青枯病，利用其进行的生物防治属于青枯菌拮抗菌的防治。

Beneduzi 等（2012）发现，PGPR 通过直接和间接的方式来促进植物生长。其直接机制包括氮的固定，产生螯合铁的铁载体，并使其作用于植物根系，促进磷增溶以及植物激素合成；间接机制是通过抑制植物病原体来促进植物生长，而PGPR 还利用多种作用方式来抑制青枯病病原体的生长，如产生抗生素起拮抗作用，产生铁载体螯合铁，生成HCN 进行空间和养分的竞争以及系统性抗性的诱导。此外，某些特定PGPR 有可能是通过使用其中任何一种或多种机制来影响植物生长的[6]。

Abd El-Rahman 等（2002）证明，假单胞菌属具备很多适合作为PGPR 的特性，并且与青枯菌成拮抗作用，能抑制青枯病的发生。其中最有效的是荧光假单胞菌属，其次为菜豆假单胞、蜡样假单胞和枯草假单胞，而且只有荧光假单胞菌能产生氰化氢（HCN）和铁载体。根际产生促生长激素的铁载体存在增加了植物对Fe3+的供应，促进了植物生长，从土壤中螯合Fe3+会抑制竞争性微生物的活性。HCN 在病原菌生物防治中发挥了有效作用。生物以HCN 形式分泌氰化物离子，这些离子代谢成较少的化合物。HCN 通过阻止电子的传输和停止向细胞提供能量而导致生物体死亡。其能够抑制酶的功能和起首细胞色素氧化酶的作用，而且还可以可逆地抑制机制受体。此外，当根瘤菌以非特异性关系定植于非豆科植物的根部时，该属菌株也能表现为PGPR，其中芽孢杆菌是根际中最常见的属。Akintokun等（2019）发现苏云金芽孢杆菌（Bt）也可用于番茄青枯病的防治。报告表明，混合生物防治微生物可改善生物防治，与单独使用拮抗菌株或两种混合使用相比，3 种或4 种拮抗菌株的混合使用出现了最高的生长促进效果。此外，有效的拮抗细菌必须筛选其在自然条件下的表现，然后标记为生物防治剂。这是因为在自然条件下，其必须有效地在宿主植物的根际环境中定植，并需要与土壤微生物区系争夺养分[7]。

5.2 青枯菌噬菌体的生物防治

目前，青枯病生物防治措施的进展对噬菌体（特别是病毒）的兴趣日益增加。噬菌体是环境中调节细菌种群数量最多的微生物，其具有潜在的生物防治作用。

噬菌体对青枯病病原菌具有溶解或溶源作用，溶解性噬菌体增殖会破坏宿主细菌细胞，对目标细菌更有效，而溶原性噬菌体是将其基因组整合到宿主细菌的基因组中并复制而不破坏细菌细胞。因此，细菌感染性疾病可以通过噬菌体的作用来治疗，这是一种生物防治方法，也被称作噬菌体疗法。此方法被认为是一种非常有前途的防治青枯病的策略[8]。

到现在为止，科学界已经发表了3 项与青枯病生物防治有关的专利。第一项是Bhunchoth 等（2015）从日本的土壤中分离到3 种具有杀灭病原菌活性的茄根瘤菌噬菌体。其通过测定噬菌体的基因组大小和寄主范围，初步鉴定该噬菌体对从烟草植物中分离出的6种日本品系青枯菌菌株的侵染能力。第二项是日本科学家发现一种名为ΦRSA1 的新型噬菌体，与之前的噬菌体相比，其宿主范围更广泛。第三项是日本科学家开发了一种预防青枯病的药剂和方法，包括将感染Φrsm1 型丝状噬菌体的菌株M4S、Ps29、Ps65 和Ps74，或Φ rsm3型丝状噬菌体感染的菌株C319、Ps72 和Ps74，分别注射到植株8～105 个细胞／g 处的茎中。这项专利的重点是预防青枯病，因为注入含有整合在其基因组中的丝状噬菌体的细菌细胞的植物，显示出对病原菌的抗性增加至少2 个月[9]。

噬菌体生物生产和配方用于可持续和环境友好型农业的生物农药将是必要的。另外，在综合防治方案中，将噬菌体作为生物防治剂与其他生物防治策略相结合也是提高对青枯病疗效的一种有前途的方法。

6 结论

青枯病作为重要作物生产的主要病害之一，严重威胁着世界范围内的作物生产。而青枯菌具备致病性决定因素众多、寄主范围广、生存能力强等特点。青枯病的生物防治主要利用青枯菌拮抗菌以及噬菌体这两种途径。

青枯菌拮抗菌可利用多种作用方式来抑制青枯病病原体的生长。例如，可以产生抗生素起拮抗作用，生成HCN，产生铁载体螯合铁，进行空间和养分的竞争以及系统性抗性的诱导等。其中假单胞菌属中的荧光假单胞菌属对青枯菌的拮抗作用最强，还包括根瘤菌属中的芽孢杆菌。此外，混合拮抗菌株的生物防治还可改善青枯病的生物防治效果。

噬菌体对青枯病病原菌具有溶解或溶源作用，其中溶解性噬菌体增殖会破坏宿主细菌细胞，对目标细菌更有效。噬菌体治疗青枯病被认为是一种非常有前途的防治青枯病的策略。研究表明，将噬菌体作为生物防治剂与其他生物防治策略相结合也是提高青枯病防治效果的一种有研究价值的方法[10]。