间充质干细胞来源外泌体在骨缺损再生中的应用与进展

张志伟 周楠 李孟奇 张锴 李朋

滨州医学院附属医院创伤骨科，滨州 256603

骨缺损的再生修复是一个复杂的过程，会对患者生活质量产生十分重要的影响。目前，自体骨等移植物已被用于骨缺损治疗，但价格昂贵，给患者家庭带来经济负担。近年来组织工程技术治疗成为骨缺损再生医学领域的热门话题。众所周知，骨缺损再生主要来自骨膜不同细胞之间的相互作用，如干细胞、软骨细胞、成骨细胞等。研究证实足量的间充质干细胞（MSCs），尤其是骨髓间充质干细胞（BMSCs）能够有效调控骨折周围的微环境以促进成骨分化。随着研究深入，MSCs 来源外泌体，因其可传递功能性RNA并介导细胞间通讯成为学者们新的研究方向。外泌体是由双层脂膜包围的圆形小颗粒，其中含有特殊类型的蛋白质和RNA，在细胞、组织器官的再生和增殖过程中有着重要作用［1］。本综述中，我们总结了骨缺损的治疗现状、介绍了MSCs来源外泌体以及骨缺损再生过程中的机制和作用。

骨缺损治疗现状

骨缺损是指因创伤、疾病或其他原因导致的骨质缺失并形成较大的间隙。机体可以自我修复小部分骨缺损，Mauffrey等［2］将缺损尺寸大于1～2 cm 或大于骨周径1/2时定义为超出“临界大小”的骨节段缺损，在没有二次干预的情况下缺损难以通过机体调控自我愈合，同时由于骨缺损的部位及周围软组织状态的影响，极易形成骨不连［3-5］。对于难以自愈的骨缺损，目前的治疗方法包括：自体骨移植、异体骨移植、Ilizarov 骨横向搬运延长术、髓内钉系统、Masquelet诱导膜技术、组织生物工程技术等［6-7］。

近年来，随着对于骨组织工程技术的研究不断深入，骨缺损的治疗逐渐有了新的思路。众所周知，骨缺损再生修复是一个多步骤、多因素的过程，其中包括骨传导、骨诱导和骨生成，并有机械稳定性和血管重建的支持［8］。而一般来说，组织工程将其包括的种子细胞、生长因子搭载于生物支架上以提供所需的机械支持，以及作为生物活性分子和药物的传递载体［9］。并发症较少、成骨量相对较多的组织工程技术得到研究人员的青睐；相较于骨移植，组织工程技术较少出现免疫排斥、带来传染病等问题；相对于Ilizarov技术，利用组织工程技术治疗具有无需多次手术、治疗周期短、感染机会小等优势。1981 年Takahashi 和Yamanaka［10］通过从小鼠中分离出胚胎干细胞并验证其具有无限生长的能力，同时能够分化为所有3 个胚层的细胞，但由于伦理原因临床使用人类胚胎干细胞存在困难，而随着技术发展，之后研究者的目光转到了目前已被广泛使用且相对容易提取培养的BMSCs［9，11］。文献指出骨髓是MSCs 最丰富的来源，BMSCs 自体具有强大的增殖能力，并能够分化为成骨所需的细胞分泌促进成骨的物质，且BMSCs 在体外培养较为容易，能够维持定向组织活性，目前多个研究证实BMSCs修复骨缺损并收获良好疗效［9，12］。Kanczler等［13］于2008 年的动物实验中将体外培养的BMSCs移植联合血管内皮生长因子搭载到生物可降解聚合物支架材料放置于大鼠股骨缺损部位，结果表现出显著的骨再生能力。随着研究深入，学者们发现MSCs所发挥的增强组织再生、减少细胞损伤与再生功能在很大程度上是由其旁分泌作用而实现的，通过间接调控细胞间通讯发挥作用，而外泌体便是其中一种重要的旁分泌因子［14-16］。

MSCs来源外泌体的生物学特性

1.外泌体的来源与结构

外泌体由Trams等［17］于1981 年首次被发现并描述为50～100 nm 的“可能具有生理功能”的小分子囊泡。首先，细胞内溶酶体微粒内陷形成多囊泡体，而后在多种刺激作用下与细胞膜融合，合成并通过胞吐的方式释放到细胞外环境形成大小均一、呈杯口状的外泌体［18］。外泌体含有脂质、核酸、蛋白质和信号分子，表面具有特定的蛋白标志物，而这些蛋白标志物根据其来源、内吞途径而有所不同［19-20］。但不同外泌体膜上都富含标志性蛋白四跨膜蛋白家族表达标志物，包括Alix、TSG101、CD9、CD81、CD63 等。首先供体细胞的质膜内化产生内小体，之后通过内小体分选复合体将蛋白质和RNAs［包括长链非编码RNA（lncRNA）、环状RNA（circRNA）、信使RNA（mRNA）和微RNA（miRNA）］选择性地包涵到多小体中，以实现物质转运。目前外泌体被定义为各种组织和细胞释放的细胞器，可通过内吞作用被受体细胞内化［21］。外泌体分布广泛，能够从几乎所有类型的生物体液中分离出来，如精液、唾液、尿液等［20，22-24］。外泌体的内吞作用可以促进蛋白质、mRNA和miRNA 的吸收，从而影响靶细胞，同时，这些功能性RNAs 通过实现细胞间信号通信，进而调节靶细胞和器官的功能、活性［25-26］。此外，外泌体中还含有多种脂肪酸、胆固醇和鞘磷脂，这些脂质不但作为运输信号分子的载体，还起到调节细胞内稳态的作用［27］。

2.外泌体的功能与特性

最初，人们认为如果能将MSCs 募集到受损组织，便可以通过环境诱导自主分化以替代并填充受损部位，达到修复的作用［28-29］。而近年越来越多的研究证明是因为外泌体中包含的蛋白质和小分子RNA 能够作为介导细胞间通信介质起到了主要作用［30］。众多研究指出外泌体内包含的各类mRNA、miRNA 等对细胞分化、活性调节至关重要［31］。外泌体能够在各种组织和器官的损伤中表现出再生修复效应，包括皮肤组织、神经组织、软骨组织、肝组织、骨组织等［32-40］。诸多学者相信外泌体因其能够促进组织再生的能力，为其在骨再生的作用探索提供了基础。同时，有学者指出外泌体因其携带的小分子RNA 及蛋白质在疾病发展过程中会有明显变化，故从血液样本或其他体液样本中分离的外泌体含量可以作为疾病可靠生物标志物［41］。外泌体的性质非常稳定，在体内是不可自我复制，相比干细胞而言大大降低了免疫风险。同时，外泌体能够在-20 ℃下体外长时间保存而不变性以致损失其功能［20］。此外，外泌体与膜结合蛋白一起释放，这些蛋白便可以很容易被改造成相应特定组织，包括骨，并被结合到细胞中。这为外泌体的体外治疗提供了必要条件。

MSCs来源外泌体在骨组织再生中的作用

随着人们对MSCs 来源外泌体促进骨缺损修复不断研究与探索，MSCs 来源外泌体将会在骨缺损修复领域拥有广阔的应用前景。研究显示外泌体能够在骨组织再生修复中加速骨的再生血管化、通过小分子RNA 调控细胞通路、调节免疫反应等多种方式参与成骨。外泌体在以上几个治疗方式中都能够显示出积极的作用。

1.加速骨再生血管化

大量文献研究发现，MSCs 来源外泌体内包含多种小分子RNA、各种细胞因子、生长因子等，能够促进细胞增殖、调控细胞凋亡。Osugi等［42］将体外培养的MSCs培养液注入大鼠颅骨骨缺损模型，并分为MSCs/琼脂糖组与MSC-CM（MSCs 培养液）组，通过Micro-CT 等技术比较发现MSCs/琼脂糖组移植后骨再生明显低于MSC-CM 组。此外，在这个实验中团队假设并验证得出MSC-CM 具有动员内源性MSCs，促进血管生成和骨再生的潜力。Furuta等［43］研究发现MSCs 来源的外泌体能够通过促进软骨内骨化在骨折愈合中发挥重要作用，团队通过在CD92/2 小鼠（已知自身产生外泌体量较少）骨折端注射MSCs 来源外泌体，在模型中发现骨折端血管形成加速，软骨细胞肥大化较前明显增快，在向对照组野生小鼠骨折端注射相同量外泌体同样发现骨折愈合加速。Qin等［44］相信这是外泌体中含有的小分子RNA 所起的作用，于是进一步研究发现miR-196a、miR-27a、miR-206 在BMSCs 来源的外泌体中呈现高表达，推测这些小分子RNA 与外泌体中含有的其他细胞因子与生长因子对成骨与加速血管化有密切关系。

2.通过信号通路调控诱导成骨

Liao等［31］通过构建兔动物模型设计对照实验发现BMSCs 来源的外泌体携带miRNA-122-5P，在体内能够促进成骨细胞的增殖与分化，并同时促进血管生成。而这一功能是通过RTK/Ras/MAPK 信号转导途径抑制SPRY2 的表达和激活RTK 的活性来实现的。Zhang等［40］构建了大鼠骨不连模型，将大鼠BMSCs来源外泌体注入断端，通过对照实验证明外泌体移植明显能够促进大鼠股骨骨不连模型的成骨、血管生成和骨愈合过程。此外，研究团队利用BMP-2抑制剂的实验证实，BMP-2/Smad1/RUNX2信号通路在大鼠BMSCs来源外泌体诱导骨形成和促进骨不连愈合中起重要作用。

3.免疫反应促进成骨

有文献指出，MSCs 来源外泌体在免疫反应中能发挥其一定的作用。Lin等［45］通过构建小鼠骨折模型，并将MSCs来源外泌体搭载于水凝胶上，利用对照实验比较有无搭载程序性死亡受体配体1（PD-L1）、外泌体的水凝胶对骨折愈合的作用效果，证实了外泌体PD-L1 与T 细胞表面的程序性死亡受体1（PD-1）偶联，降低免疫反应以促进小鼠骨折愈合，同时此实验证明了携带活性因子的外泌体可以搭载嵌入到一种新型的水凝胶中以应用于局部骨折部位缓慢释放，提供了一种新型支架的可行方案。一般来说，在机体损伤的情况下，体内巨噬细胞的耗竭不利于组织的再生和修复。Kim等［46］通过研究发现MSCs 来源外泌体中含有白细胞介素（IL）-6、IL-12、前列腺素E2、巨噬细胞刺激因子等细胞因子以及血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子等。而外泌体的注入能够提高体内巨噬细胞水平，以促进组织的再生。有学者在研究中发现，通过在受损部位局部注射MSCs 来源外泌体能够诱导M2 巨噬细胞的极化以改善炎性微环境，促进受损界面的纤维软骨再生，加速组织的修复进程［47］。

外泌体在应用中的局限性

然而在外泌体进入临床应用之前，仍然有许多问题等待研究者们解决。首先，目前实验中提取分离外泌体大多采用超速离心法，耗费时间长的同时得到的量较低，因此对其高效提取的研究十分重要。其次，需要了解影响调节特定生物活性分子在外泌体内组装的因素和机制。在不同来源的外泌体中含有的活性分子具有较大差异，例如，与成骨相关的生物因子在正常骨髓来源的MSCs 外泌体中大量表达，而在骨恶性肿瘤细胞来源的外泌体中却提取出能够破骨细胞增殖分化的因子，致使骨质的破坏。同时，应用外泌体后在体内是否会作用于其他组织器官而引起不良反应尚不清楚。

小结

通过简述骨缺损再生修复的治疗现状，介绍了MSCs来源外泌体的结构功能与特性，阐述了MSCs来源外泌体参与骨缺损再生方式，比较了MSCs来源外泌体与其他方式应用于治疗骨缺损再生的优缺点，得出结论：外泌体能够动员并募集内源性MSCs 以加速骨再生血管化、通过RTK/Ras/MAPK 信号通路诱导成骨、抑制免疫反应等方式参与骨的再生。应用外泌体治疗其具有免疫风险低、易搭载等优势。应用外泌体进行治疗是一种极有前景的治疗方式，是骨组织工程的应用热点。外泌体在组织修复尤其是骨再生领域，有很大的应用前景和研究价值，相信在不久的将来在组织工程技术促进骨缺损再生修复中，尤其是在由创伤等因素造成大段骨缺损骨不连的治疗等医学难题上能够取得突破性的进展，从而推动骨缺损再生领域医学事业的不断进步。