基于网络药理学探讨黄芪治疗股骨头缺血性坏死的作用机制*

王明明，程 延

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中医医院，陕西 西安 710003)

股骨头坏死(ischemic necrosis of the femoral head，INFH)是一种临床常见疾病，多种原因均可导致股骨头血供出现紊乱，最终引起骨细胞死亡，出现骨小梁断裂、股骨头塌陷、骨坏死等为最终结果的髋关节功能减退的一种骨科常见疾病[1]。其分为创伤性和非创伤性，病因多见于创伤、过量饮酒、服用大量激素类药物、有减压舱工作史[2]等。根据ONFH中国分期将其分为临床前期(I期)、早期(Ⅱ期)、塌陷前期(中期，Ⅲ期)、塌陷期(中晚期，Ⅳ期)、骨关节炎期(晚期，Ⅴ期)五期[3-5]。现代医学认为INFH发病渐进、缓慢，病因与血运障碍、脂质代谢紊乱、骨内压增高、基因多态性、免疫因素等多种因素有关，但具体发病机制仍不明确，国内提出了包括脂肪代谢紊乱、血管内凝血、血管功能障碍等多种学说，其中静脉瘀滞、骨内高压学说普遍为骨科界所接受，该病的最终共同通路是股骨头的血运损害。这些学说从微观角度揭示，主要是静脉回流障碍和骨内压增高的同时又影响到动脉的血供，造成股骨头的细胞受压、坏死，最终导致INFH[6-10]。

股骨头缺血性坏死的治疗主要分为非手术治疗、手术治疗等两个方面。根据患者不同的需求，采取不同的治疗方案。对于早、中期患者，大多数患者采取非手术治疗，以缓解病情进展为原则。中医对于早中期患者方案多样，内服中药是治疗INFH的主要形式，以活血化瘀、补肾强骨的药物为主。辅以其他治疗如外用中药热敷、针灸、小针刀、推拿按摩以及患肢功能锻炼等治疗，起到延缓、甚至逆转病情的进展。

黄芪，迄今已有2000多年的药用历史，归脾、肺经，其味甘，性微温。具有补气升阳，益卫固表、利水消肿，生津养血，托毒生肌、行滞通痹，敛创生肌的功效[11]。现代药理学研究表明，黄芪中的黄酮类、多糖类、皂苷类、氨基酸类等均发挥着药理作用[12]，具有调节机体免疫功能的作用[13]。

本研究是以系统生物学[14]等相关理论，借助网络药理学(network pharmacology)方法和计算机相关软件技术为基础，探讨黄芪的有效成分与相关蛋白靶点之间的互作关系，探索黄芪中多成分、多靶点、多机制、多通路治疗股骨头缺血性坏死的作用机制，为黄芪在临床治疗股骨头缺血性坏死提供临床科学依据及应用参考。

1 资料与方法

1.1 黄芪的有效成分筛选及其靶点获取 利用中药系统药理分析平台(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，在Herb name中输入黄芪(或Huangqi)，检索黄芪的活性成分，通过相似性(DL)和生物利用度(OB)进行筛选黄芪的高活性成分。经查阅文献，选择化合物类药性(Drug-Like，DL)≧0.18，口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≧30%[15]的化学成分作进一步分析。作为筛选阈值选择出所需要的高活性的关键活性成分，同时将高活性成分所对应的靶点蛋白检索出来。

1.2 黄芪的高活性成分靶点蛋白规范 由于黄芪的高活性成分靶点来源于不同数据库，会引起靶点名称不统一，因此要对筛选出的靶点蛋白要和基因信息进行校正。利用蛋白质数据库Uniprot(https：//www.uniprot.org/)、NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库，将1.1所获得的靶点蛋白在数据库中进行搜索，选择已验证过的“Homo sapiens”，将蛋白质靶点进行校正、规范，获取标准的靶点名称。

1.3 股骨头缺血性坏死靶点及交集靶点的获取 利用Genecards(https：//www.genecards.org/)、OMIM(http：//omim.org/)等数据库，在输入栏输入“股骨头缺血性坏死”英文全称：Ischemic necrosis of the femoral head，获得股骨头缺血性坏死的疾病靶点，去除重复项后并经过Uniprot规范后整理获得INFH相关疾病靶点，并将其输出为Excel表格保存。运用R语言(4.1.2版本)系统将获得的黄芪高活性成分蛋白基因与INFH靶点基因进行韦恩分析，获取黄芪治疗INFH的交集靶点。

1.4 黄芪-活性成分-疾病-疾病靶点基因网络图建立 借用Cytoscape3.7.2软件将黄芪与INFH的交集靶基因与黄芪高活性成分建立黄芪-活性成分-疾病-疾病靶点基因网络图，并利用插件NetworkAnalyzer计算相关网络特征值，以阐明黄芪治疗INFH的作用机制。网络图中，节点代表高活性成分和靶基因，线代表节点之间相互作用的关系。

2 结果

2.1 筛选出黄芪高活性成分和靶点蛋白 利用TCMSP检索出953个作用靶点基因，经过口服生物利用度、类药性筛选后得到20个活性成分和462个作用靶点，其中主要作用成分并经过查阅相关文献[16-21]包括：含丁子香萜、熊竹素(华良姜素)、常春藤皂苷元、β-谷甾醇、异鼠李素、3，9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇 tol、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、黄芪紫檀烷苷、联苯双酯、刺芒柄花素、毛蕊异黄酮、山柰酚、叶酸、黄芪异黄烷苷、1，7-二羟基-3，9-二甲氧基紫檀烯、槲皮素。利用Uniprot、NCBI等数据库规范并去重后，获得相关靶基因197个。其黄芪20个药效活性成分及OB(%)、DL参数如下：见表1。

表1 黄芪药效活性成分及对应OB(%)、DL参数

续表1

2.2 INFH疾病的靶点筛选及交集靶点 借用Genecards、OMIM数据库检索，去重规范及整合后得到936个靶基因，将2.1所获得的197个药物靶基因借用R语言与其计算，共得到69个交集靶点，分别为PGR、NOS2、PTGS1、AR、PTGS2、ESR2、DPP4、ESR1、PPARg，PPARD、NCOA1、F2、NOS3、XDH、HTR3A、KDR、IL4、SIRT1、HSD3B1、AKT1、BCL2、TNF、MMP1、STAT1、CYP3A4、ICAM1、SELE、VCAM1、INSR、GSTM1、MMP3、EGFR、VEGFA、CCND1、CDKN1A、PLAU、MMP2、MMP9、IL10、RB1、IL6、TP53、NFKBIA、SOD1、ERBB2、MYC、F3、GJA1、IL1B、CCL2、CXCL8、TGFB1、IL2、PLAT、THBD、SERPINE1、COL1A1、IFNg，PTEN、IL1A、PARP1、PPARA、CRP、CXCL10、SPP1、RUNX2、IGF2、CD40Lg，RASA1。交集Venny图可视化见图1。

图1 药物-疾病交集靶点基因Venny图

2.3 建立中药-活性成分-疾病-疾病靶点基因网络图 借用Cytoscape3.7.2软件构建黄芪、活性成分及INFH疾病靶点基因之间的相互作用关系，将其相互之间的联系进行可视化，建立黄芪-活性成分-疾病靶点基因网络可视图，图中左边粉色为中药，即黄芪，中间绿色为黄芪高活性成分，浅绿色为疾病，即INFH，紫色和红色代表所有靶基因，单独红色代表黄芪-INFH共同靶基因(即黄芪治疗INFH作用靶基因)，线代表中药、活性成分、疾病及靶点之间的相关性。通过插件cytoNCA按着度degree、紧密度closeness两种属性分别取排序靠前的成分有：常春藤皂苷元、异鼠李素、刺芒柄花素、毛蕊异黄酮、山柰酚、槲皮素等。如图2。

2.4 蛋白质PPI相互作用网络图的构建 将黄芪-疾病交集靶点基因导入到STRING数据库进行蛋白互作分析，筛选出分值在0.9以上的蛋白互作关系，构建蛋白(PPI)互作关系网络图。共有69个节点、202条边，平均节点度为5.86，平均局部聚类系数是0.537，图中的“边”代表靶基因之间的联系，“边”的粗细表示：边越粗，相互之间的结合度就越大，combine score值就越大；其中作用靶基因用节点表示。见图3。经过分析发现，分值为0.99或以上的互作蛋白有56对：AKT1-NOS3、AR-NCOA1、CCND1-CDKN1A、CCND1-ESR1、CDKN1A-TP53、EGFR-RASA1、ESR1-NCOA1、ESR2-NCOA1、F2-THBD、KDR-VEGFA、NCOA1-PPARg，NCOA1-PPARA、PLAT-SERPINE1、PLAU-SERPINE1、PTEN-TP53、SIRT1-TP53、AR-CCND1、CCND1-RB1、CXCL8-IL1B、EGFR-ERBB2、ESR1-NOS3、PPARG-SIRT1、CXCL8-IL6、IL1B-IL6、EGFR-ESR1、EGFR-STAT1、ESR1-RUNX2、IL10-TNF、NCOA1-PGR、BCL2-TP53、CCL2-CXCL8、IL10-IL1B、IL1A-IL1B、CCL2-IL6、CXCL8-IL10、ESR1-TP53、IL6-TNF、PPARA-SIRT1、PTGS2-TP53、AKT1-CDKN1A、CCL2-IL1B、IL1A-IL6、IL4-TNF、AKT1-PTEN、CCL2-TNF、CXCL8-TNF、NFKBIA-TNF、RB1-RUNX2、CCL2-CXCL10、CCND1-MYC、F2-F3、IL4-IL6、MMP9-TGFB1、IL1B-IL4、IL6-TGFB1、RB1-TP53，这些靶点蛋白之间的相互作用关系极其重要。

图3 黄芪潜在治疗靶基因的互作关系网络图

借用Cytoscape3.7.2软件，将黄芪潜在治疗INFH疾病靶基因互作关系Degree值进行可视化，其中Degree值越大，代表黄芪作用于此靶基因的作用越大，即图中形状越大，反之则小。其中Degree值较大的靶基因为：IL6、TNF、IL10、AKT1、TP53、ESR1、STAT1。见图4。

图4 黄芪潜在治疗靶基因互作关系Degree可视化图

利用插件计算每个基因节点的连接个数，绘制Degree排列靠前的35个靶基因进行可视化展示，构建PPI核心基因条形图，见图5。

图5 PPI核心基因条形图

2.5 GO富集分析 借用DAVID数据库将黄芪-INFH交集靶点进行GO功能富集分析，包括生物过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)，经过P≤0.05进行规范筛选后，共富集到GO条目426项，其中BP、CC、MF分别为347、23、56项。表明中药黄芪可通过多项BP、CC、MF治疗INFH，BP、CC、MF分别前10项富集分析结果的条形图和气泡图详见图6。(图中条形长度表示富集的基因个数，条形颜色代表分类，气泡图颜色代表富集的程度，气泡的大小代表富集的基因个数)

图6 黄芪治疗股骨头缺血性坏死GO富集分析条形图和气泡图

2.6 KEGG通路富集分析 将黄芪-INFH交集靶点进行KEGG通路富集分析，并借用String数据库进行规范校正，筛选P值≤0.05的条目，共富集到78条信号通路，将其按照P值大小由小到大进行排列，将排列前20名的通路绘制成条状图和气泡图，见图7。

图7 KEGG通路富集分析条形图和气泡图

3 讨论

近年来，由于外伤、激素与酒精应用不当，股骨头缺血性坏死患者逐年增多[22]。据流行病学调查研究显示国内股骨头患者高达约800万例[23]。祖国医学将其隶属于“骨痹”“骨痿”及“骨蚀”的范畴，早期病因以气滞血瘀为多，属“髋骨痹”的范畴；而中期以骨枯筋软为特征，属于“骨痿”的范畴；晚期股骨头出现塌陷和软骨损伤，多属于“骨蚀”的范畴[24]。本病病机以本虚标实多见，肝肾亏虚为本虚，气滞、痰浊、血瘀为标实[25]，并将其致病因素归纳为虚、痰、瘀[26]。有研究表明，黄芪中芒柄花素、毛蕊异黄酮等黄酮类、及黄芪甲苷等皂苷类具有改善微循环的作用[27]。本研究从药物-疾病Venny网络图可知，黄芪中刺芒柄花素、毛蕊异黄酮、山柰酚、槲皮素、异鼠李素等20个化合物作用于INFH疾病相关的69个靶点，进一步证明了黄芪是通过多成分、多靶点共同协作治疗INFH。

PPI互作关系网络图是靶点之间相互作用的可视化体现，靶点之间的相互作用，构成了复杂的生物网络体系，其中连接度越大，表明黄芪通过此靶点治疗股骨头缺血性坏死的可能性越大。通过PPI筛选可知IL6、TNF、IL10、AKT1、TP53、ESR1、STAT1等可能是黄芪治疗INFH的关键靶点。相关研究发现，白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是一种多功能、多效应及多向性的细胞因子[28]。是一种可溶性介质，对炎症、免疫反应和造血功能、骨代谢具有多重作用[29]。在炎性疾病中如类风湿性关节炎，IL-6的持续表达可以增强破骨细胞的形成、分化及间接影响成骨细胞凋亡[30-31]。Kamiya，N等[32]研究指出IL-6是股骨头坏死活跃期滑膜中存在的特异性炎性细胞因子。Yamaguchi等[33]学者也指出关节软骨细胞产生的IL-6是由于HIF-1α的激活，刺激了滑膜细胞的炎症反应，并认为缺氧关节软骨细胞产生的IL-6刺激滑膜细胞增殖和炎性细胞因子反应，其机制可能是缺血性骨坏死的诱导通过HIF-1信号传导途径导致关节软骨中的IL-6活化。并提出阻断IL-6是治疗缺血性骨坏死后滑膜炎的前景治疗方法。通过PPI网络分析，采用cytoHubba 插件计算出黄芪作用于IL6的连接度最大，极有可能说明黄芪可通过抑制IL6等促炎性因子进而治疗INFH疾病。

通过GO富集分析预测出，黄芪治疗INFH的BP作用机制可能是通过RNA聚合酶II启动子的转录正调控(Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、基因表达的正向调节(positive regulation of gene expression)、蛋白质磷酸化的正向调控(positive regulation of protein phosphorylation)、药物反应(Response to drug)、炎症反应(inflammatory response)、负调控凋亡过程(negative regulation of apoptotic process)通过细胞外隙(extracellular space)、细胞外区(extracellular region)、酶结合(Enzyme binding)、蛋白结合(Protein binding)产生治疗作用的。

依据KEGG通路富集分析结果可知，预测出黄芪治疗INFH疾病的治疗通路，其治疗过程中相关度较高的治疗通路可能与膀胱癌(Bladder cancer)、疟疾(Malaria)、癌症(Pathway in cancer)、乙型肝炎(Hepatitis B)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)等。从富集分析得到的结果来看，说明黄芪的活性成分所对应的核心靶点映射在不同的通路上，是通过多条通路共同发挥药效，进一步表明了其研究机制。

综上所述，黄芪治疗INFH的作用机制可能是其有效活性成分通过IL6、TNF、IL10、AKT1、TP53、ESR1、STAT1等关键靶基因通过调控膀胱癌、疟疾、癌症、乙型肝炎、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路等互相介导而产生抑制炎症、提高免疫和神经递质，从而调控机体改善股骨头坏死的症状。通过调控RNA聚合酶II启动子的转录正调控、基因表达的正向调节、蛋白质磷酸化的正向调控、药物反应、炎症反应、负调控凋亡过程等和通过膀胱癌、疟疾、癌症、乙型肝炎、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路等多条相关信号通路共同协作治疗INFH疾病的作用。本研究通过网络药理学方法揭示了黄芪有效成分、靶基因、通路之间的相互协作关系，发现黄芪治疗INFH是通过多成分、多靶点、多通路的作用机制，进而验证了黄芪治疗INFH是通过多途径、多方面产生抑制炎症、提高免疫和神经递质的作用机制，体现了中医药治疗疾病的整体观念。进一步为黄芪治疗股骨头坏死的临床应用提供了更为严谨的理论基础。