基于线粒体Cyt b基因序列的浙江省3个马口鱼群体遗传多样性分析

刘士力，练青平，贾永义，迟美丽，李 飞，姜建湖，刘一诺，郑建波，程 顺，顾志敏，*

(1.浙江省淡水水产研究所 农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室/浙江省淡水水产遗传育种重点实验室，浙江 湖州 313001； 2.上海海洋大学 农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306)

马口鱼(Opsariichthysbidens)隶属于鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，马口鱼属，因其上颌两侧边缘各有一个缺口，正好与下颌的突起相吻合，形似马口，故名“马口鱼”，在中国南北各大水系、水库、溪流皆有分布，多生活于溪流及水库等清澈水体中，尤其喜在水流较急的浅滩、底质为砂石的小溪和江河支流中集群生活，以小鱼、小虾、水生昆虫等为食[1-2]。马口鱼为肉食性经济鱼类，肉质鲜美，深受山区广大消费者喜爱。金丹璐等[3]对马口鱼的胚胎发育和仔稚鱼生长进行了观察，马口鱼繁殖技术已获得突破，在人工养殖条件下投喂配合饲料生长良好。目前，在南方山区已经形成成熟的马口鱼养殖业，马口鱼已成为山区的重要经济鱼类之一，市场前景广阔[4-5]。

线粒体DNA(mitochondrial DNA， mtDNA)标记技术被广泛应用于水生动物的遗传多样性分析[6-9]。Zardoya等[10]研究发现，细胞色素b (cytochrome b，Cytb)的进化速率适中，替换、缺失和插入等突变能够稳定持续遗传，可适用于种间、种内的遗传分析。马口鱼具有较高的营养与经济价值，通过线粒体Cytb基因序列开展遗传结构研究，对于种群的保护与良种选育具有重要意义。高嘉昕等[11]基于Cytb基因序列对长江上游干流及支流的13个地理种群的大鳞马口鱼(O.macrolepis)进行研究，发现所有单倍型可分成2个谱系，表现出东-西方向的地理差异。Perdice等[12]基于Cytb基因对珠江、长江和海河水系的马口鱼系统发育进行分析发现了5个谱系，这些谱系间的遗传差异已达到种间水平。Li等[13]基于Cytb基因序列分歧发现中国马口鱼以南岭为界分为2大谱系，认为这2个谱系可能对应2个不同的种。邓艳等[14]通过Cytb序列对伊洛河马口鱼遗传结构进行分析时发现伊洛河马口鱼存在2个分支，推测2个分支间线粒体DNA的遗传差异可能源自于祖先种群或者种间杂交。钱塘江和瓯江是浙江省最大的2条河流，暂未见对其马口鱼遗传多样性的研究，人工繁殖对于马口鱼遗传多样性的影响也未见报道。本实验将浙江瓯江(OJ)和钱塘江(QTJ) 2个野生群体及八里店(BL)养殖群体的线粒体细胞色素b(Cytb)基因全长进行扩增，并与GenBank中国内主要河流的数据进行比较分析，探明浙江这3个群体的遗传结构，为马口鱼的种质资源保护、良种选育与开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验采用浙江省野生群体2个，养殖群体1个。其中野生群体为2017年10月采自瓯江(丽水段)和钱塘江(衢州段)，野生群体各取33尾样本。养殖群体32尾，于2021年6月采自浙江省淡水水产研究所八里店综合试验基地(湖州)，其亲本为2017年自钱塘江(衢州段)引进经3次传代留种的后代。剪取适量尾鳍组织，采用无水乙醇保存，储存于4 ℃冰箱中。

主要试剂：PCR试剂购自宝日医生物技术(北京)有限公司；用于DNA提取的试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用苯酚-氯仿法提取样本DNA。用1%琼脂糖凝胶检测所获DNA的完整性。将检测合格的DNA溶液于-20 ℃保存备用。

1.2.2 线粒体COI基因片段的扩增与序列测定

根据GenBank公布的马口鱼线粒体基因及其侧翼DNA序列(登录号：KX925976)应用Primer Premier 6.0软件设计Cytb扩增和测序的引物Cyt b-F和Cyt b-R。Cyt b-F：5′-TTAACCGAGACCAATGACTT-3′；Cyt b-R：5′-TAGGAACCAGATACCAGGAA-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系和反应条件参照文献[15]。扩增PCR产物用 1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测合格后送生工生物工程(上海)股份有限公司采用上下游引物进行双向测序。

1.2.3 序列分析

用于比较分析的序列来自Perdices等[12]的138条序列(GenBank登录号：AY646512.1-AY646649.1)和Li等[13]的98条序列(GenBank登录号：FJ601919.1-FJ602016.1)。通过BioEdit 7.0软件对序列进行比对分析并对照原始序列峰图进行人工校对。应用Mega 6.0软件计算碱基含量，并采用邻接法基于Kimura’s 2-Parameter模型建立系统进化树。运用DnaSP 5.0软件计算单倍型数、单倍型多样性指数(h)、变异位点数目和核苷酸多样性指数(π)。使用Arlequin 3.1中的分子方差分析(AMOVA)法计算固定指数(Fst)，并进行中性检验，计算Tajima’s D和Fu’s FS参数，以此推测群体的历史演化。

2 结果与分析

2.1 马口鱼Cyt b基因碱基组成与变异分析

本实验对浙江省马口鱼3个群体98个样本的Cytb基因进行了扩增和测序。共获得了98条1 590 bp的同源序列，提交GenBank后获得登录序列号为：MZ507432-MZ507529。选择其中1 140 bp编码Cytb的序列用于下一步分析。将这98条序列与GenBank中获得的236条序列进行综合分析。结果显示，在1 045个位点(除去部分序列存在的缺失碱基)中存在变异位点288个，简约信息位点254个，分别占分析位点的27.6%和24.3%。平均转颠换比值(TS/TV)为12。4种碱基在334条序列中平均含量为A (24.2%)、G (16.7%)、T (29.7%)和C(29.4%)，其中G的含量最低，A+T含量为53.9%，明显高于C+G含量。浙江的3个群体碱基组成差异不大(表1)。

表1 马口鱼3个群体Cyt b基因序列的碱基组成

与GenBank中的序列进行综合分析。在334个个体发现了136种单倍型，其中33个瓯江样本仅有1种单倍型，33个钱塘江样本具有10种单倍型，八里店群体具有6种单倍型。八里店群体和钱塘江群体共享3个单倍型(表2)。钱塘江群体与湖南的澧水和沅江样本具有共享单倍型(图1)。

OJ， 瓯江； QT， 钱塘江； BL， 八里店； LS， 澧水； YJ， 沅江； ZS， 资水； LJ， 漓江； LIU， 柳江； MJ， 闽江； HH， 淮河； LC， 澜沧江；NP， 南盘江； YE， 黄河。OJ， Oujiang； QT， Qiantang River； BL， Balidian； LS， Lishui River； YJ， Yuanjiang River； ZS， Zishui River； LJ， Lijiang River； LIU， Liujiang River； MJ， Minjiang River； HH， Huaihe River； LC， Lancang River； NP， Nanpan River； YE， Yellow River.图1 基于马口鱼Cyt b单倍型构建的NJ系统进化树Fig.1 NJ molecular dendrogram based on Cyt b haplotype of O. bidens

表2 马口鱼3个群体Cyt b基因序列的单倍型分布情况

2.2 马口鱼Cyt b基因遗传结构分析

使用DnaSP(version 5.0)软件计算马口鱼3个群体的遗传多样性参数(表3)，结果显示，3个群体的单倍型(0～0.716)和核苷酸(0～0.016 16)的多样性程度具有明显分化。瓯江群体仅有1种单倍型，单倍型和核苷酸多样性为0。钱塘江群体的单倍型数和多样性高于八里店群体，表明马口鱼3个群体具有不同的遗传多样性。

表3 马口鱼群体Cyt b基因序列的遗传多样性参数

3个马口鱼群体线粒体DNACytb基因序列的遗传差异AMOVA分析结果表明，群体间的Fst=0.550 55 (P<0.01)，整个遗传变异中群体间占55.06%，其余的遗传变异来自于群体内(44.94%)，总体上，群体间具有较高程度的遗传分化(表4)。

表4 马口鱼群体线粒体Cyt b基因序列分子方差分析

2.3 各群体遗传距离分析

通过Mega 6.0软件计算各地理种群间遗传距离，所得结果见表5。由表5可知，各群体间遗传距离为0.012 072～0.027 505，遗传距离差距较大。其中瓯江与八里店群体的遗传距离最近，瓯江与钱塘江群体的遗传距离最远。运用Arlequin计算各群体间的Fst在0.402 95～0.696 61。3个群体之间的遗传分化系数都大于0.25，其中瓯江群体与另外2个群体的遗传分化系数均在0.5以上。

表5 马口鱼3个群体间的遗传距离(对角线下方)和固定指数(对角线上方)

基于马口鱼浙江省3个群体线粒体Cytb基因序列分析获得了14种单倍型，加上选取GenBank中具有代表性的7种单倍型，对其采用邻接法构建系统发育树(图1)，显示钱塘江群体大致分为3个分支。其中第1分支与长江水系湖南省采集的样品较为接近，63.64%的钱塘江个体属于这1支，另有1分支与珠江水系广西漓江采集的样品聚为一支；剩下1大支包含全部的瓯江群体和剩余的八里店、钱塘江个体，这个分支是以前的调查中没有发现的单倍型分支。这说明钱塘江群体的祖先来源有一定的复杂性。本实验为研究浙江省马口鱼的来源和种质资源提供了第一手素材，具有一定的指导意义。

2.4 群体动态分析

群体中性检验显示，瓯江群体的Tajima’s D和Fu’s Fs值为0，钱塘江和八里店群体的Tajima’s D和Fu’s Fs值为正值，3个群体Tajima’s D和Fu’s Fs检验均不显著(P>0.01)。由于瓯江群体33个样本为单一单倍型，不存在多态性，不能进行核苷酸不配对分布分析。对钱塘江和八里店群体进行中性检验和核苷酸不配对分布(mismatch distribution)分析的结果显示，马口鱼钱塘江和八里店群体核苷酸不配对分布呈现多峰型(图2)，在中性检验中Tajima’s D值均为正值，但统计结果不显著(P>0.05)，表明瓯江和八里店群体没有经历群体扩张，群体大小保持相对稳定。

A，钱塘江；B，八里店。A， Qiantang River； B， Balidian.图2 马口鱼核苷酸错配分布图Fig.2 The nucleotide mismatch distribution of O. bidens

3 讨论

Cytb基因作为线粒体中重要的蛋白质编码基因，进化速率适中，被广泛应用于遗传结构分析中。对移植到北方松嫩平原区湖泊、水库的大银鱼(Protosalanxhyalocranius)群体的采用Cytb分析时发现，大银鱼93.81%的遗传差异来自群体内，6.19%来自群体间。但群体间遗传分化均达到显著水平或极显著水平，这和各水体不同批次移植、投放大银鱼受精卵的特征是一致的[16]。隋宥珍等[17]采用Cytb序列分析了黄海、东海和南海口虾蛄(Oratosquillaoratoria)群体间的遗传变异，结果表明，可明显分为3个谱系，其单倍型类群组成在空间上的分布频率存在显著差异。Perdices等[12]对采自长江、珠江和海河3个水系的28个马口鱼群体进行了研究，认为这些样本包含5个谱系，在这5个谱系间存在高度的遗传分化，92%的遗传分化是由于谱系的不同，不同水系间较多的不共享单倍型数量和中等水平的核苷酸多样性表明，它们可能是独立进化的，最终得出中国的马口鱼可以分为5个种的结论。Li等[13]结合Perdices等[12]的数据进行了分析，认为马口鱼Cytb由4个类群组成，隶属于2个分支，可分为2个种。本实验补充了中国东部瓯江和钱塘江的样品情况，其中部分样品可以构成一个新的类群。

钱塘江是浙江省最大的河流，虽然不属于长江的支流，但具有一些河道相通。因此钱塘江和长江水系湖南省采集的群体具有共享单倍型。瓯江位于浙江南部，为浙江省第二大江，距离长江有一定距离。其仅包含有1种单倍型。从现有的数据看，这个单倍型是瓯江独有的，但仍待进一步采集样品进行验证。瓯江这个单倍型先和钱塘江的部分单倍型聚在一起，然后和淮河、黄河中的部分单倍型聚集在一起。根据Grant等[18]的标准，钱塘江群体符合鱼类第4种单倍型与核苷酸多样性组合，即高h和高π类型。造成这个结果的原因为群体可能由一个大而稳定的群体经过长时间演化所产生或由多个不同系群的群体二次接触所形成。通过本文的单倍型进化树分析，符合多个不同系群的群体二次混合形成。瓯江群体符合鱼类第1种单倍型与核苷酸多样性组合，即低h和低π类型[18]。该群体最近遇到瓶颈效应或者由少量母系个体繁殖而来。八里店人工繁育群体种源来自于钱塘江，虽然由于马口鱼怀卵量较少，人工繁殖采用的亲本数量较多，但经过数代人工繁殖，单倍型数、单倍型多样性及核苷酸多样性都有所降低。需要在避免人工养殖群体逃逸对野生资源的影响的同时，制定科学的繁育策略预防群体遗传多样性降低对养殖造成的不利影响。

衡量种群多态性的重要指标包括种群间的遗传距离以及遗传分化指数。Shaklee等[19]提出鱼类在属、种和种群三级水平上的遗传距离分别为0.90、0.30及0.05的分类依据。本文中的浙江3个群体的分化属于种群的水平。根据Wright[20]采用固定指数(Fst)作为衡量群体间遗传分化程度的标准，3个群体属于极高度分化。本文中，种群间的遗传距离分析与Fst的分析结果并不完全一致。其中八里店与钱塘江群体的遗传分化系数最低，但八里店群体与瓯江的遗传距离更近一些。这可能是由于八里店样本中81.3%的个体处和瓯江同一分支中，但八里店群体仅有27.3%的样本处于这一分支中。在此前的研究中，不同水系没有共享单倍型。这不仅和地理距离较远有关系，也和采集的样本数量和采样点的密度有关。钱塘江除了具有和长江、珠江水系共享的单倍型外，自身还具有特有的单倍型。随着数据库中马口鱼Cytb基因序列数量的逐渐增多，Cytb基因已成为研究马口鱼群体遗传多样性的重要分子标记。本研究获得的钱塘江和瓯江野生群体的Cytb数据是马口鱼种质数据的重要补充，对八里店养殖群体的分析表明其遗传多样性有所降低。研究结果为浙江省马口鱼的种质资源分类评估、种群关系研究及长期稳定保护和利用提供了重要参考依据。