不同极性溶剂对金银花中酚酸类成分提取率的对比研究

赵逸卿 陈士国 张慧杰 葛晓雨 杨 蕊 张艺灵 马瑞鹏 丁文静 郭绍芬*

（1临沂大学药学院，山东临沂 276005；2浙江大学山东（临沂）现代农业研究院，山东临沂 276005；3临沂市农业科学院，山东临沂 276005）

金银花又名双花和忍冬，为忍冬科忍冬属植物。忍冬的干燥花蕾或初开的花是历史悠久的中药，具有清热解毒和疏散风热等疗效[1]。金银花含有黄酮类、酚酸类、挥发油类、环烯醚萜苷类和三萜皂苷类等化学成分，在临床有解热抗炎、抗菌、抗氧化、抗病毒、增强免疫和护肝利胆等药理作用[2-4]，其中酚酸类成分为金银花抗病毒主要成分，且具有抗氧化、抑菌[5]和抗炎[6]等作用。金银花中所含的酚酸类成分主要是绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸C等[7-8]，其中绿原酸含量是金银花质量控制的一种指标[9]。绿原酸也是金银花表现生物活性的一种关键有机物，抗病毒和保肝利胆等临床效果显著，应用较为广泛，相关研究也比较深入[10]。因此，从金银花中提取酚酸类成分以及提高酚酸类成分的提取率有重大意义。

本研究以6种不同基源的金银花为原料，分别为红花、线花、大毛花、北花一号、四季花、九丰一号。使用不同极性的溶剂进行加热回流提取，通过高效液相色谱测定每种金银花提取物的酚酸类成分含量，从而探究不同极性溶剂对金银花中酚酸类成分提取率的影响，为进一步提高酚酸类成分提取率提供理论依据。

1 材料与试剂

1.1 供试品

供试品包括红花、线花、大毛花、北花一号、四季花，九丰一号，符合《中华人民共和国药典（2020版）》中关于中药金银花的规定。

1.2 材料与试剂

乙醇、磷酸、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚用分析级，购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司；乙腈和甲醇用色谱级，购自美国天地公司；超纯水，绿原酸，异绿原酸A和异绿原酸C均为标准品，购自上海蓝季科技有限公司。

2 试验方法

精密称取绿原酸对照品适量，置于棕色量瓶中，加50%甲醇摇匀制成每含0.4 mg/mL的溶液。

精密称取异绿原酸A对照品和异绿原酸C对照品适量，置于棕色量瓶中，加50%甲醇摇匀制成每含0.15 mg/mL和每含44 mg/mL的溶液。

2.1 样品溶液制备

将6种不同基源金银花净选，除去叶和叶柄等杂质，称取50 g金银花研碎，置于圆底烧瓶中，加入提取溶剂，使提取溶剂液面没过金银花，于圆底烧瓶中浸泡40 min，加热回流1 h，倾出上清液，再次加入提取溶剂加热回流40 min，合并滤液，抽滤，50℃旋蒸至适量体积，转移至水浴锅中加热挥发得到金银花提取物浸膏，称重备用。

2.2 高效液相色谱法测绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸C含量

检测仪器为Agilent 1260高效液相色谱仪，色谱柱为Ultimate C18(4.6 mm×150 mm,5μm)，流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液等梯度洗脱，乙腈为0.4%磷酸溶液=14∶86，流速为0.7 mL/min，检测波长327 nm，进样量10μL。绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸C采用外标一点法[11]进行含量计算，计算公式如下：

式中C为标准品浓度；A1为标准品峰面积；A2为供试品峰面积；V为容量瓶体积；M1为供试品质量；M2为总浸膏质量；M3为称取的金银花总质量。

3 数据分析

本研究数据以平均值为计算值，数据分析采用SPSS 13.0软件和Origin 8.5软件进行数据处理。

4 结果与分析

4.1 不同极性溶剂对酚酸类成分提取率的影响

用不同极性溶剂对6种基源的金银花中酚酸类成分进行提取。由图1可知，不同极性溶剂对绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸C的提取率有显著性的差异（P＜0.01）。极性较大溶剂如水和乙醇等提取率较高，可有效提高绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸C的溶出量，而极性较小溶剂如乙酸乙酯、氯仿和石油醚提取率较低，不利于绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸C的溶出。因此，水和乙醇均可作为最佳的提取溶剂，与刘金磊等[12]研究结果一致，原因可能是绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸C是极性较大的酚酸，根据相似相溶原理，更易溶解在水和乙醇。

图1 不同溶剂对6个品种金银花的绿原酸，异绿原酸A和异绿原酸C的提取率

4.2 水和乙醇提取对酚酸类成分提取率的影响

用水和乙醇提取6种不同基源金银花中的酚酸类成分。由图2可知，不同基源的金银花中的绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸C对水和乙醇的溶出量不同。对于绿原酸，红花和四季花在以水和乙醇为溶剂的提取下，绿原酸含量无显著性差异（P＞0.05），其他4种基源的金银花在以水和乙醇为溶剂的提取下，绿原酸均具有显著性差异（P＜0.02），其中北花一号在以乙醇为提取溶剂时，绿原酸提取率最高，为2.598%。对于异绿原酸A，大毛花在以水和乙醇为溶剂的提取下异绿原酸A无显著性差异（P＞0.05），其他5种基源的金银花在以水和乙醇为溶剂的提取下，绿原酸均具有显著性差异（P＜0.02），其中九丰一号在以水为提取溶剂时，异绿原酸A的提取率最高，为5.969%。对于异绿原酸C，北花一号在以水和乙醇为溶剂的提取下，绿原酸无显著性差异（P＞0.05），其余5种基源的金银花在以水和乙醇为溶剂的提取下，绿原酸均具有显著性差异（P＜0.01），其中九丰一号在以水为提取溶剂时，异绿原酸C的提取率最高，为2.273%。原因可能是绿原酸属于有机弱酸，多以离子形式溶解在水溶液中，以分子形式溶解于乙醇溶液中，高温时绿原酸分子电离率增加并使其更易溶解于水中，在乙醇中的溶解度相对变小[13]。因此，线花和大毛花中的绿原酸在以水为提取溶剂时的提取率相较于以乙醇为提取溶剂时高。但是，高温还会导致绿原酸的结构不稳定，可能会使其他物质溶出，相对降低了绿原酸的提取率[14]。因此，其他物质溶出的影响使得北花一号和九丰一号等品种的绿原酸在水中提取率低于在乙醇中的提取率。异绿原酸类化合物极性较大，溶于水和乙醇中，但是异绿原酸A的活化能为96.71 KJ/mol，其在中性水溶液中的降解反应对于温度较为敏感[15]，造成异绿原酸A的提取率下降，对于异绿原酸A含量少的红花、线花和四季花尤为显著，使得乙醇提取的异绿原酸A含量高于水提取的异绿原酸A含量，而对于异绿原酸A含量较高的北花一号和九丰一号影响较小，使得水提取的异绿原酸A含量高于乙醇提取的异绿原酸A含量。异绿原酸C的极性更接近于水，根据相似相溶原理，异绿原酸C的在水中的溶解度要高于在乙醇中的溶解度。

图2 水和乙醇对6个品种金银花的绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸C的提取率

5 结论

本文通过使用6种不同极性溶剂对同种金银花酚酸类物质进行回流提取，探究其酚酸类物质绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸C含量变化，结果表明，不同溶剂对金银花的酚酸类成分溶出量具有显著影响（P＜0.01），其中以水和乙醇为提取溶剂的提取率高于其他3种溶剂，因此可选择水和乙醇作为最佳提取溶剂。同时考察了同种溶剂对6种基源不同的金银花中酚酸类成分提取率的影响，结果表明在以水为提取溶剂的条件下，大毛花的绿原酸提取率最高，可达1.40%；水提九丰一号的异绿原酸A和C的提取率最高，可达5.969%和2.273%；以乙醇为提取溶剂，九丰一号的异绿原酸A和C的提取率最高，可达1.76%和0.52%，显著高于2醇提其他基源的金银花；2醇提北花一号的绿原酸的提取率最高，可达2.598%。

综上所述，可选取水和乙醇作为金银花酚酸类成分提取的最佳溶剂，其不仅可以最大限度提取酚酸类物质，相比其他3种有机溶剂也更为经济环保。乙醇对绿原酸的提取率更高，水对于异绿原酸A和C的提取率更高，因此可以将乙醇作为溶剂来提取金银花中的绿原酸，水为溶剂提取异绿原酸A和C。而对于6种基源不同的金银花来说，无论是在水还是乙醇为溶剂的条件下，九丰一号具有显著性优势，其酚酸类成分提取率显著高于其他品种，本次研究有助于后续进一步开发九丰一号的经济与使用价值。