慢性阻塞性肺疾病60例血浆锁链素、维生素K水平变化及临床意义

于凡珍, 陈烁, 李家树

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是呼吸系统疾病中的常见病和多发病, 是以持续气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病, 其气流受限多呈进行性发展。目前认为慢性炎症和蛋白酶-抗蛋白酶失衡是COPD的主要发病机制[1］。锁链素是近年发现的弹性蛋白特征性水解产物, 其体液含量可以反映肺组织中弹性蛋白的代谢情况, 被认为是肺损伤的敏感指标[2］。维生素K是γ-谷氨酰羧化酶的辅酶, 是激活凝血因子等多种蛋白质的重要辅因子。基质Gla蛋白（matrix gla protein, MGP）也是一种依赖维生素K激活的蛋白质, 具有抑制软组织钙化的重要作用。既往研究显示维生素K可通过催化MGP的谷氨酸残基羧化生成活性人羧化基质Gla蛋白（cMGP）, 从而发挥抑制组织弹性蛋白钙化、降解的作用[3-5］。循环中去羧化（Dp-uc；即非活性）MGP水平与维生素K水平呈负相关, 已被用来评估血浆维生素K水平[6］。研究发现血浆维生素K水平下降可引起肺弹性蛋白降解增加, 并与肺气肿的发生呈明显负相关[7-8］。目前锁链素、维生素K在COPD中的作用并未完全清楚, 本研究的目的在于探讨COPD病人血浆锁链素、维生素K水平及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2020年12月至2021年7月徐州医科大学附属连云港医院收治的COPD病人为研究对象。病例纳入标准：（1）纳入COPD病人均符合中华医学会呼吸学分会《慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2013年修订版）》[1］中关于COPD的诊断标准。（2）一般资料完整, 能够配合该研究顺利进行。排除标准：（1）合并与锁链素、MGP相关的系统性疾病如严重心血管及皮肤损伤性疾病；（2）合并除COPD以外的其他呼吸系统疾病；（3）合并有严重的肝肾、内分泌、炎性肠道疾病、神经系统疾病、恶性肿瘤及血液系统疾病；（4）服用维生素K拮抗剂（如苯丙酸酯和华法林等）或脂溶性维生素或其类似物治疗者, 器官移植史病人等。

本研究共纳入COPD病人60例为COPD组, 另选取同期体检中心健康体检病人30例为对照组。对照组一般资料完整, 能够配合该研究顺利进行。组间性别构成、年龄、体质量指数、吸烟指数等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）, 具有可比性。见表1。

表1 健康体检对照组与慢性阻塞性肺疾病（COPD）组一般资料比较

本研究经徐州医科大学附属连云港医院伦理委员会审核批准（KY-20210714001-01）, 病人或其近亲属签署知情同意书。

1.2 检测指标

1.2.1 血浆锁链素、非活性基质Gla蛋白（Dp-uc-MGP）水平 COPD组与对照组病人均于就诊当天, 用乙二胺四乙酸抗凝管抽取静脉空腹晨血5 mL, 混合10～20 min后, 离心5 min左右（3 500 r/min）, 仔细收集上清, -80 ℃冰箱冷冻备用。血浆锁链素、DpucMGP采用酶联免疫吸附测定（ELISA）进行检测, 试剂盒均购自上海将来实业江莱生物。

1.2.2 血清炎性因子水平 COPD组与对照组病人均于就诊当天, 用不含抗凝剂的真空采血管抽取静脉空腹晨血5 mL, 混合10～20 min后, 离心5 min左右（3 500 r/min）, 仔细收集上清, 送该院检验科采用流式细胞仪（贝克曼库尔特生物科技有限公司）检测白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平。

1.2.3 肺功能 COPD组与对照组病人均于就诊当天, 采用肺功能测量仪（德国JAEGER）进行肺功能测定, 记录第1秒用力呼气容积占预计值百分比（FEV1%）、一氧化氮弥散量（DLCO）。所有操作均由同一专业肺功能医师在同一肺功能仪上进行。

1.3 COPD病人分组（1）根据2020年慢性阻塞性肺疾病全球倡议中规定的慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）诊断标准将不同进展期病人分为COPD稳定期组和AECOPD组：COPD稳定期组30例, 其中男25例, 女5例, 年龄（67.30±7.77）岁, 体质 量 指 数（25.16±3.34）kg/m2, 吸 烟 指 数705.00±448.24；AECOPD组30例, 其中男25例, 女5例, 年龄（66.67±5.38）岁, 体质量指数（24.82±4.42）kg/m2, 吸烟指数681.67±427.00。（2）根据COPD病人本次入院前1年内急性加重次数分组：前一年发生2次及以上中/重度急性加重, 或1次及以上因急性加重住院的病人为COPD高风险组, 余为COPD低风险组。其中COPD高风险组27例, 其中男23例, 女4例, 年龄（66.70±7.66）岁, 体质量指数（25.20±4.26）kg/m2, 吸烟指数709.26±472.52；COPD低风险组33例, 其中男27例, 女6例, 年龄（67.12±5.76）岁, 体质量指数（24.81±3.61）kg/m2, 吸烟指数680.30±407.15。

以上COPD稳定期组和AECOPD组、COPD高风险组和COPD低风险组组间性别构成、年龄、体质量指数、吸烟指数等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）, 具有可比性。

1.4 统计学方法采用SPSS 26.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示, 方差齐的组间比较采用独立样本t检验, 方差不齐的组间比较采用Mann-Whitney检验；非正态分布的计量资料采用中位数（第25、第75百分位数）[M（P25,P75）］表示, 组间比较采用Mann-Whitney检验。计数资料采用例数表示, 组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson进行。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 COPD组与对照组锁链素、Dp-ucMGP、炎性因子及肺功能指标比较与对照组相比, COPD组血锁链素、Dp-ucMGP、IL-6、TNF-α水平较高（P＜0.05）, 肺功能指标FEV1%、DLCO较低（P＜0.05）, 见表2。

表2 健康体检对照组与COPD组锁链素、Dp-ucMGP、炎性因子及肺功能指标比较/±s

表2 健康体检对照组与COPD组锁链素、Dp-ucMGP、炎性因子及肺功能指标比较/±s

注：COPD为慢性阻塞性肺疾病, Dp-ucMGP为非活性基质Gla蛋白, IL-6为白细胞介素-6, TNF-α为肿瘤坏死因子-α, FEV1%为第1秒用力呼气容积占预计值百分比, DLCO为一氧化氮弥散量。

组别对照组COPD组t（Z）值P值例数30 60锁链素/（μg/L）1.84±0.89 3.03±0.96 5.69＜0.001 Dp-ucMGP/（μg/L）8.93±1.78 11.24±1.45 6.60＜0.001 IL-6/（ng/L）2.45±1.41 3.97±1.91 3.86＜0.001 TNF-α/（ng/L）2.95±1.79 6.19±3.17（4.57）＜0.001 FEV1%/%81.65±11.46 53.44±16.43 6.68＜0.001 DLCO/mmol·min-1·kPa-1 6.22±0.94 4.31±1.29 5.85＜0.001

2.2 不同进展期COPD病人锁链素、Dp-ucMGP、炎性因子、肺功能指标比较与COPD稳定期组相比, AECOPD组血浆锁链素、Dp-ucMGP水平差异无统计学意义（P＞0.05）, 但炎性因子血清IL-6、TNF-α水平均明显升高（P＜0.05）, 肺功能指标FEV1%、DLCO均明显降低（P＜0.05）, 见表3。

表3 不同进展期COPD病人血锁链素、Dp-ucMGP、炎性因子及肺功能指标比较水平比较/±s

表3 不同进展期COPD病人血锁链素、Dp-ucMGP、炎性因子及肺功能指标比较水平比较/±s

注：COPD为慢性阻塞性肺疾病, Dp-ucMGP为非活性基质Gla蛋白, IL-6为白细胞介素-6, TNF-α为肿瘤坏死因子-α, FEV1%为第1秒用力呼气容积占预计值百分比, DLCO为一氧化氮弥散量, AECOPD为慢性阻塞性肺疾病急性加重期。

组别AECOPD组COPD稳定期组t值P值例数30 30锁链素/（μg/L）2.97±0.99 3.08±0.94 0.44 0.664 Dp-ucMGP/（μg/L）11.35±1.50 11.14±1.42 0.55 0.583 IL-6/（ng/L）4.45±2.13 3.48±1.56 2.01 0.049 TNF-α/（ng/L）8.01±2.65 4.38±2.56 5.39＜0.001 FEV1%/%49.17±13.99 57.72±17.77 2.07 0.043 DLCO/mmol·min-1·kPa-1 3.80±0.97 4.82±1.37 3.31 0.002

2.3 不同风险组COPD病人锁链素、Dp-ucMGP、炎性因子、肺功能指标比较与COPD低风险组相比, COPD高风险组血浆锁链素、Dp-ucMGP、IL-6水平均明显升高（P＜0.05）, 肺功能指标FEV1%、DLCO均明显降低（P＜0.05）, 见表4。

表4 不同风险组COPD病人血锁链素、Dp-ucMGP、炎性因子及肺功能指标比较水平比较

2.4 COPD病人血浆锁链素、Dp-ucMGP水平与炎性因子及肺功能指标的相关性COPD病人血浆锁链素、Dp-ucMGP水平与炎性因子血清IL-6、TNF-α均呈明显正相关（均P＜0.05）；与肺功能指标FEV1%、DLCO均 呈 显 著 负 相 关（均P＜0.05）, 见表5。

表5 COPD病人血浆锁链素、Dp-ucMGP水平与炎性因子及肺功能指标的相关性（r,P值）

2.5 COPD病人血浆锁链素、Dp-ucMGP水平之间的相关性COPD病人血浆锁链素水平与Dp-uc-MGP水平呈显著正相关（r=0.76,P＜0.001）。

3 讨论

近年来研究发现, 弹性蛋白与COPD发病密切相关, 在COPD的发病过程中常伴随异常的弹性蛋白降解和修复[9］。正常情况下, 分解人肺组织的弹性蛋白酶和抗弹性蛋白酶抑制剂之间处于动态平衡状态, 从而维持肺组织的正常结构不被破坏[10］。当慢性炎症、吸烟、空气污染等刺激使蛋白酶-抗蛋白酶失衡时, 蛋白酶水解肺弹性蛋白增加, 导致弹性蛋白降解加速及肺气肿。

锁链素是纤维状弹性蛋白的水解产物, 由4个赖氨酸的侧链交联而成, 是交联弹性蛋白纤维特有的氨基酸, 只存在于哺乳动物的弹性蛋白中。锁链素作为成熟弹性蛋白的主要成分, 在肺组织中分布极为丰富。当肺内蛋白酶-抗蛋白酶失衡导致肺组织结构破坏时, 弹性蛋白降解增加, 释放锁链素也会增加。释放出的游离锁链素结构稳定, 不参与机体的分解代谢, 因此可作为肺损伤破坏的生化指标。既往研究表明, COPD病人体液中锁链素水平由高到低依次是：急性加重期、稳定期、健康对照组[11］。Huang等[12］发现部分稳定期和急性加重期COPD病人血液中的锁链素水平高于健康对照组, 但稳定期和急性加重期病人血液中的锁链素水平无显著差别。柳威等[13］则发现稳定期COPD组诱导痰锁链素水平明显高于健康对照组, 并与FEV1、FVC呈负相关。Kim等[14］进一步研究证实尿中锁链素水平升高是COPD病人肺气肿的独立预测因子, 并与COPD的频繁加重显著相关。Piscaer等[7］也发现COPD组血浆锁链素水平显著高于健康对照组, 并与肺功能指标DLCO呈负相关, 但与FEV1、FEV1%等无明显相关性。本研究结果显示, COPD组病人血浆锁链素水平明显高于对照组；而且, COPD高风险组病人血浆锁链素水平明显高于COPD低风险组病人, 提示血浆锁链素水平可以反映COPD的急性加重风险。但不同进展期COPD病人之间血浆锁链素水平无显著差别, 这与Huang等[12］研究结果一致。究原因可能是在AECOPD期间, 弹性蛋白降解速度相对较慢, 短期内升高不明显所致。同时, COPD高风险组IL-6、TNF-α、FEV1%、DLCO较COPD低风险组均显著下降, 反映该组病人慢性炎症更重, 肺功能低下。进一步相关性分析, COPD病人血浆锁链素与炎性因子IL-6、TNF-α均呈显著正相关, 提示COPD存在的慢性炎症可促进肺弹性蛋白降解。另外, COPD病人血浆锁链素还与肺功能指标FEV1%、DLCO呈显著负相关, 提示锁链素与COPD病人肺损伤严重程度有关, 可作为评估COPD病情严重程度的指标。但是, 血浆锁链素水平与FEV1%、DLCO之间相关性的研究结果并非总是一致的, 考虑其原因可能与入组COPD病人严重程度不一、研究样本量偏小有关。

维生素K又称凝血维生素, 是一种常见的脂溶性维生素, 具有止血、控制细胞生长及凋亡、抗炎、抗氧化应激等广泛作用[15］。已有证据表明维生素K可通过降低IL-6、TNF-α、C反应蛋白等多种促炎细胞因子的表达来发挥抗炎作用[16-17］。此外, 维生素K还是γ-谷氨酰羧化酶的辅酶, 可协助催化蛋白质中的谷氨酸残基生成γ-羧化谷氨酸[3］。MGP是一种14 kDa的分泌型小分子蛋白, 可表达于心、肺、肾、皮肤和动脉血管壁等多种组织中。研究发现, MGP是维生素K依赖的软组织钙化抑制剂[18］。维生素K可促使MGP的5个谷氨酸残基转化为带负电荷的Gla, 产生钙结合位点, 进而发挥抑制组织弹性蛋白钙化、降解的作用[4,19］。Piscaer等[7］研究发现与对照组相比, COPD病人血浆维生素K水平显著降低, 且其与弹性蛋白降解指标锁链素呈负相关, 提示维生素K在COPD的发病中可能起一定作用。在另一项关于深绿色蔬菜和肺气肿风险之间联系的研究中, Shen等[8］发现维生素K摄入量与肺气肿的发生呈负相关；与摄入低于推荐剂量维生素K的人群相比, 摄入推荐剂量维生素K可使患肺气肿的概率降低39%。最近, Dofferhoff等[20］也发现新冠肺炎病人预后不良与其血浆维生素K缺乏相关。他们认为肺炎引起的血浆维生素K耗竭可导致MGP的激活受损, 这是重症肺炎弹性纤维损伤加速的主要机制。

本研究结果显示, COPD组病人血浆Dp-ucMGP水平明显高于对照组, 即COPD病人血浆维生素K水平明显低于对照组。推测其原因可能与COPD病人维生素K摄入不足、慢性炎症消耗和维生素K循环个体差异相关[19］。而且, COPD高风险组病人血浆Dp-ucMGP水平明显高于COPD低风险组病人, 提示血浆Dp-ucMGP水平可以反映COPD的急性加重风险。相关性分析显示COPD病人血浆Dp-ucMGP水平与炎性因子IL-6、TNF-α正相关, 这可能与维生素K抗炎作用的发挥相关。此外, COPD病人血浆Dp-ucMGP水平与肺功能指标FEV1%、DLCO呈显著负相关, 提示Dp-ucMGP也与COPD病人肺损伤严重程度有关。COPD病人血浆Dp-ucMGP水平还与锁链素呈显著正相关, 即血浆维生素K与锁链素呈显著负相关, 表明维生素K缺乏在COPD发病中的起一定作用, 其机制可能与促进肺弹性蛋白降解相关, 这与Piscaer等[7］研究结果相一致。

综上所述, COPD病人血浆锁链素和Dp-ucMGP水平明显升高, 且与炎性因子、肺功能指标呈明显相关, 可作为评估COPD病情严重程度的血浆标志物。由于COPD病人血浆维生素K水平下降, 且与锁链素呈显著负相关, 推测维生素K可能参与了肺弹性蛋白降解过程, 这或可成为缓解COPD病人病情进展的新思路, 但仍须进一步地补充试验提供更多证据。但是, 锁链素在COPD病人中的研究结果并不统一, 而且目前维生素K和Dp-ucMGP在COPD中的相关研究较少, 仍有待于大规模、长期随访临床研究来进一步探索。