维吾尔族成人急性髓系白血病（非急性早幼粒细胞白血病）骨髓肾母细胞瘤基因1和转录因子ETS-1表达与预后的关系

阿依姆妮萨·阿卜杜热合曼, 姑丽斯坦·阿不都热西提, 阿斯亚·麦麦吐逊, 努尔比亚·阿布都热西提

急性髓系白血病（AML）是一类高度异质性疾病, 以髓系原始细胞增高为主要特征, 大多数AML病人病情急重, 预后凶险, 如不及时治疗可危及生命[1-3］。肾母细胞瘤基因1（WT1）在生理及病理性造血过程中承担着重要角色, 其表达水平与多种恶性血液疾病的发生、发展、治疗密切相关, WT1基因在绝大部分AML病人中均表现为异常高表达, 其过度表达可作为“泛白血病”的分子标志物, 具有十分重要的意义[4-7］。转录因子ETS-1属于ETS转录因子家族成员之一, 其在细胞增殖、分化及组织重构等多种生物学过程中发挥着重要作用, 能够调节尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化物, 基质金属蛋白酶等一系列与细胞外基质重建有关的基因表达, 从而使细胞黏着性降低, 有利于肿瘤的浸润生长和转移[8-10］。目前, 国内外对于转录因子ETS-1在维吾尔族成人新发AML（非M3）病人中的表达水平变化情况及意义的研究尚未见报道, 故本研究通过检测WT1和ETS-1基因的表达水平, 旨在探讨二者在AML（非M3）发生发展、疗效评估中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2015年6月至2018年10月喀什地区第一人民医院血液科收住的105例维吾尔族初诊AML（非M3）病人为观察组, 男60例, 女45例, 年龄（40.12±5.38）岁。选取同期于该院100例健康体检者为对照组A, 及在该院治疗的100例汉族初诊AML（非M3）病人为对照组B。对照组A男61例, 女39例, 年龄（39.55±5.45）岁；对照组B男60例, 女40例, 年龄（39.74±5.62）岁。三组研究对象一般资料比较, 详见下文“2.1”结果部分。

样本量计算：利用PASS 15软件, 设α=0.05, 把握度（power）=90%,OR=2, 双侧检验, 计算得到样本量N1=N2=67例, 考虑可能有失访人数, 按20%算,N1、N2至少需要80例。因此, 本研究纳入105例维吾尔族初诊AML（非M3）病人为观察组, 100例健康体检者为对照组A、100例汉族初诊AML（非M3）病人为对照组B。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 纳入与排除标准纳入标准：（1）病人均为初诊者, 经血常规、免疫分型及临床症状等综合诊断, 符合《血液病诊断及疗效标准》[11］相关诊断标准且参照FAB分型标准；（2）病人均已成人；（3）所有研究对象及其近亲属知情同意, 并签署知情同意书。排除标准：（1）慢性粒细胞白血病；（2）合并恶性肿瘤；（3）合并严重感染；（4）入组前已接受相关治疗者；（5）临床资料不完整者。

1.3 治疗方法AML（非M3）治疗方法参照2011年版《成人急性髓系白血病（非急性早幼粒细胞白血病）中国诊疗指南（2011年版）》[12］。根据病人年龄及体质等具体情况接受相关诱导治疗, 并在治疗过程中检测骨髓恢复情况对方案进行相应调整。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 主要试剂与仪器 Real MasterMix试剂, 购自天根生化科技有限公司；日立超高速冷冻离心机, 购自美国Thermo MicroMax公司；多功能酶标仪, 购自上海首立实业有限公司。低温高速离心机, 购自美国Sigma公司；Trizol RNA提取试剂盒、TaKaRa逆转录试剂盒, 购自美国InvitRogen公司；实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）仪, 购自美国Bio-Rad公司；分光光度计, 购自上海舜宇恒科仪器有限公司；引物, 由上海生工生物工程股份有限公司合成等。

1.4.2 WT1和ETS-1 mRNA表达水平检测 无菌条件下常规抽取对照组及AML（非M3）病人骨髓1～2 mL, 乙二胺四乙酸抗凝, -80 ℃冻存, 以qRT-PCR法检测骨髓中WT1和ETS-1表达水平。以TRizol RNA提取试剂盒提取样本总RNA, 紫外分光光度法鉴定各样本提取的RNA纯度和完整性。按照逆转录试剂盒说明书将血清RNA逆转录合成互补DNA（cDNA）。WT1正向引物：5＇-ATGGAGAAGGGTTACAGCAC-3＇, 反向引物：5＇-ATGCTTGAATGAGTGGTTGG -3＇；内参ABL正向引物：5＇-AAGCTGGTGGGCTGCAAATC-3＇, 反 向 引 物：5＇-GTTCCAACGAGCGGCTTCA-3＇。ETS-1正向引物：5'-TGATGTGGGCTGTGAATGAG-3', 反向引物：5'-TGAAGTAATCCGAGGTGTAACG-3'；内参GAPDH正向引物：5'-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3', 反 向 引 物：5'-GGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'。引物序列均由上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR反应体系20 μL：2.5×Real MasterMix 8 μL；正反向引物各0.4 μL；荧光探针0.8 μL；MGB Taqman探针10 μL；cDNA样本2 μL；加双蒸水至20 μL。选择qPCR反应程序上机, 共40个PCR循环, qPCR扩增条件：42 ℃, 30 min；94 ℃, 5 min；94 ℃, 45 s；60 ℃, 80 s。以2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。

1.5 统计学方法运用统计学软件SPSS 20.0对数据进行处理。计数资料以例（%）表示, 比较采用χ2检验；符合正态分布计量资料以±s表示, 三组间比较行单因素方差分析, 差异有统计学意义时两两比较采用SNK-q检验；不符合正态分布计量资料采用中位数（第25、第75百分位数）[M（P25,P75）］表示, 组间比较采用Wilcoxon秩和检验；多因素logistic回归分析AML（非M3）的影响因素；并采用Kaplan-Meier方法描述生存曲线。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较观察组与对照组年龄及性别比较, 差异无统计学意义（P＞0.05）。观察组和对照组B白细胞计数明显高于对照组A, 血小板计数及血红蛋白明显低于对照组A, 均差异有统计学意义（均P＜0.05）；观察组和对照组B病人白细胞计数、血小板计数及血红蛋白比较, 差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 三组一般资料比较

2.2 三组骨髓WT1、ETS-1表达水平比较三组骨髓WT1和ETS-1表达水平相比, 差异有统计学意义（P＜0.05）。观察组和对照组B骨髓WT1和ETS-1表达水平明显高于对照组A（P＜0.05）, 观察组病人骨髓WT1、ETS-1表达水平明显高于对照组B（P＜0.05）。见表2。

表2 三组骨髓WT1、ETS-1表达水平比较

2.3 logistic回归分析AML（非M3）的影响因素将是否发生AML作为因变量（否=0, 是=1）, 将白细胞计数、血小板计数、血红蛋白、WT1、ETS-1（均为连续变量）作为自变量纳入模型。logistic回归分析显示, WT1、ETS-1均是AML（非M3）的危险因素（P＜0.05）。见表3。

表3 logistic回归分析AML（非M3）的影响因素

2.4 骨髓WT1和ETS-1与病人预后关系105例AML（非M3）病人均完成1疗程的诱导治疗, 1疗程后完全缓解67.62%（71/105）, 部分缓解22.86%（24/105）, 未缓解9.52%（10/105）。对病人进行为期3年的随访, 期间有31例病人死亡（完全缓解2例, 部分缓解19例, 未缓解10例）, 20例病人随访期间疾病进展, 3年无进展生存率为51.43%（54/105）。

以AML（非M3）病人WT1、ETS-1中位数为界, 以WT1值＞0.71为WT1高表达组（48例）, 以ETS-1值＞0.92为ETS-1高表达组（57例）。采用Kaplan-Meier分析显示, WT1低表达组3年无进展生存率（68.42%）明显高于高表达组（31.25%）（χ2=4.80,P=0.028）, ETS-1低表达组3年无进展生存率（75.00%）明显高于高表达组（31.58%）（χ2=6.56,P=0.010）。见图1。

图1 维吾尔族成人急性髓系白血病（非急性早幼粒细胞白血病）105例骨髓肾母细胞瘤基因1（WT1）和转录因子ETS-1表达的生存曲线：A为WT1；B为ETS-1

3 讨论

AML是髓系造血干细胞恶性疾病, 以骨髓与外周血中原始和幼稚髓性细胞异常增生为主要特征, 目前认为白血病的发生、发展与多种相关基因的表达失常或（和）抑癌基因失活有关, 可能是遗传学和环境因素共同作用的结果, 临床表现为贫血、出血、感染和发热及代谢异常等, 多数病人病情急重, 如不及时治疗常可危及生命[13-14］。AML的治疗难度大且易复发, 其治疗以化疗和造血干细胞移植为主要手段, 与化疗相比, 造血干细胞移植可有效地提高生存率, 并且在一定程度上有可能根治白血病[15-16］。

WT1最初是从肾母细胞瘤细胞中分离出来的, 是抑癌基因也是一种癌基因, 可与多种造血调控因子相互作用, 具有增强或抑制目的基因转录的作用, 调控造血细胞的增殖、凋亡以及分化[17-18］。WT1在白血病的发病机制中起着癌基因的作用, 可导致细胞分化障碍, 诱导耐药, 抑制凋亡, 在绝大多数AML病人的外周血或骨髓中存在高表达, 但在正常人群中微量表达, 且AML病人WT1 SNP rs16754不同基因型在性别分布上存在差异, 对AML其他临床特征没有影响[9］。AML过度表达可作为“泛白血病”的分子标志, 临床上, 其表达情况可用于判断病人是否需要造血干细胞移植及微小残留病灶（MRD）的疗效, 而MDR1基因与白血病的多药耐药现象相关, AML病人MDR1和WT1表达水平存在相关性[6］。窦翠云等[19］研究指出, WT1基因在AML病人的表达水平明显高于正常骨髓, 与此研究结果相似, 本研究中, 观察组骨髓WT1表达水平明显高于对照组A和对照组B, 提示WT1基因可能参与AML（非M3）的发生及发展进程, 在维吾尔族AML（非M3）病人中同样表现为明显的升高。

ETS-1是从鸟类白血病病毒E26中提取出来的原癌基因c-ETS-1的表达产物, 发挥着转录调节作用, 故称转录调节因子, 是ETS家族具有代表性的转录调控因子, 也是其发现最早研究最多的成员之一。ETS-1主要是通过调节一些与基质降解有关酶类等基因的表达来参与组织重构过程, 是介导组织纤维化的重要转录因子, 在淋巴细胞发育、血管形成、炎症、肿瘤的生长和侵袭转移等方面具有重要作用, 相关研究表明, ETS-1是血管形成过程中必需的调节因子, 在乳腺癌等多种肿瘤疾病中表现为高表达, 并证实其有促进血管形成作用, 参与肿瘤的浸润和转移过程[12, 20］。本研究结果显示, 观察组病人ETS-1表达水平明显高于对照组A和对照组B, 表明ETS-1可能在AML（非M3）的发生发展中起着一定作用。本研究结果还显示, 维吾尔族骨髓WT1、ETS-1表达水平高于汉族病人, 提示骨髓WT1、ETS-1表达可能存在一定的民族差异性, 导致民族差异的原因可能是由于不同群体有各自不同的优势等位基因从而造成遗传学上存在一定的差异, 但由于WT1、ETS-1在AML中的研究较少, 其在不同种族之间的表达仍需更多的研究验证。logistic回归分析显示, WT1、ETS-1均是影响AML发生危险因素, 提示两者可能也存在调控作用, 参与AML的发生、发展过程, 临床检测应该对两者给予一定重视。另应用K-M分析显示, WT1、ETS-1低表达组生存率高于高表达组, 说明WT1、ETS-1异常高表达可能与病人预后有关, 提示两者可能作为评估预后生物标志物。

综上所述, 维吾尔族成人AML（非M3）病人骨髓WT1和ETS-1水平呈高表达, 二者与疾病的发生发展密切相关, 可能作为临床治疗和疗效评估的参考指标。但由于本研究选取时间较短, 今后还需扩大样本容量, 深入探讨WT1和ETS-1的相互关系及其参与AML（非M3）的具体调控机制。