蜂蜜掺假鉴别技术研究进展

王加众，杜福民，王海洲，潘秋霞

（1.山东省日照市动物疫病预防控制中心，山东 日照 276826；2.山东省日照市畜牧兽医管理服务中心，山东 日照 276826）

1 前言

蜂蜜是蜜蜂采集花蜜酿造而成的一种甜味且高营养的物质。蜂蜜一般分为两大类，即花蜜和蜜露蜜[1]。花蜜的来源是花的花蜜，而蜜露蜜是昆虫吸食植物液汁后排出的甜物质，后经蜜蜂采集酿制而成的蜂蜜。蜂蜜的主要成分是碳水化合物，大部分为单糖（果糖和葡萄糖），少量为多糖（蔗糖）和低聚糖。除了糖，蜂蜜中还含有微量的有机酸、蛋白质和矿物质。另外，由于蜂蜜中有机酸（0.5%左右）和游离氨基酸（0.05%～0.1%）的含量过多，致使蜂蜜呈微酸性，对蜂蜜的口感及理化性质起到重要影响[2]。

2 蜂蜜中主要掺假物

蜂蜜是一种天然生产的有机甜味剂，无需任何加工就可以直接食用。一些不法商人为了提高蜂蜜的产量，通过在天然蜂蜜中添加便宜的甜味剂，从中牟取暴利。蜂蜜中最常见的掺假物有高果糖玉米糖浆（HFCS）、玉米糖浆（COSS）、倒置糖浆（ISS）和蔗糖糖浆（CASS）[3]。在不同的地域中，掺假物的隐蔽性是选择它们与否的决定因素。欧洲国家的蜂蜜通常掺入果糖和菊粉，因为纯正蜂蜜中也含有果糖和菊粉的主要糖成分，不容易鉴别。大米糖浆和麦芽糖糖浆是我国蜂蜜中最常见的掺假物，也是因为它们难以用普通的分析方法检测。值得注意的是，蜂蜜掺假不仅限于在天然蜂蜜中直接添加糖，还可以在主要花蜜流动季节用浓缩糖液间接喂养蜂群。由于蜜蜂在食用糖浆后所进行的加工过程以及糖转化后所生产产品的性质具有不明确性，这种不负责任的行为不仅危害到消费者的福利，还可能导致健康问题，尤其对儿童和老年人的影响尤为严重。另外，喂食玉米糖浆的蜜蜂死亡率特别高，这可能是因为玉米糖浆中含有大量的羟甲基糠醛，对蜜蜂来说是有毒的。将昂贵的蜂蜜与便宜的蜂蜜混合是蜂蜜掺假的另一种形式，一般发生在昂贵的金合欢蜂蜜上，这种蜂蜜通常与便宜的油菜蜂蜜混合在一起，以获得更高的利润。

3 蜂蜜中掺假物检测方法

3.1 稳定碳同位素比值分析

稳定碳同位素比值分析（Stable Carbon Isotope Ratio Analysis，SCIRA）是公认的蜂蜜掺假检测的标准方法之一，可用于区分不同植物来源的蜂蜜。SCIRA 对蜂蜜检测的原理是基于单子叶植物（甘蔗和玉米）和双子叶植物（蜜蜂采集花蜜的开花植物）具有不同的13C/12C 同位素比值，这是由于植物进行光合作用循环的结果，通常以δ13C 表示，以‰表示与VPDB（Vienna Pee Dee Belemnite）内标的偏差。C3 植物通过还原型戊糖磷酸循环进行光合作用的δ13C 值在-21‰到-32‰之间，而C4 植物通过二羧酸循环进行光合作用的δ13C 值在-12‰到-19‰之间。根据White and Winters 制定的标准，δ13C 值超过-23.5‰的蜂蜜可能掺假[4]，因为蜜蜂偏好从C3 植物中获取花蜜，极少数从C4 植物中获取花蜜，但若蜜蜂从C4 植物采集花蜜时，就会出现假阳性。为了避免这种情况，通常在估算δ13C 值之前使用高效液相色谱分离蜂蜜中存在的单糖，但高效液相色谱分离成本高、样品制备繁琐耗时、蛋白质提取过程长，不适合对大量蜂蜜样品进行监测。

3.2 色谱技术

3.2.1 薄层色谱法

薄层色谱法（Thin Layer Chromatography，TLC）是一种鉴别天然蜂蜜中未知化学成分存在的简单方法。例如，便宜的高果糖玉米糖浆的单糖组成与天然蜂蜜相当，但纯蜂蜜的薄层色谱显示1 或2 个Rf 值大于0.35 的蓝/ 灰点，而掺假的高果糖玉米糖浆蜂蜜显示额外的斑点或明显的蓝色条纹[5]。尽管TLC可以简单快速地检测蜂蜜中是否添加工业糖浆，但是其可靠性需要进一步评估。此外，随着掺假物种类增多，如甜菜糖、倒置糖和大米糖浆等，TLC 检测掺假蜂蜜的可靠性有待进一步加强。

3.2.2 气相色谱分析

气相色谱（Gas Chromatography，GC）是一种直接对挥发性和半挥发性化合物分析的技术，广泛应用于准确检测蜂蜜中单糖、双糖、三糖和掺假物（如HFCS、HFIS 和ISS），现已成为第一个以菊糖为标记物成功检测高果糖玉米糖浆的技术[6]。

3.2.3 液相色谱分析

液相色谱（Liquid Chromatography，LC）检测蜂蜜掺假的原理是基于对C3 和C4 糖的鉴别。通常，配有脉冲安培检测的LC 主要用于分析果糖，并与多元统计主成分分析相结合，可对蜂蜜中的掺假成分进行量化。然而，由于繁琐的样品制备过程和需要专业人员进行高效液相色谱分析，使得LC 检测蜂蜜掺假的实用性受到限制。

3.2.4 高效阴离子交换色谱-脉冲电流检测

高效阴离子交换色谱结合脉冲电流检测（HPAEC-PAD）系统可以准确地检测碳水化合物的组成，包括单糖、二糖、寡糖和多糖。其原理是pKa 值（酸解常数的对数）在12～14 之间的微酸性糖或碳水化合物可以很容易地转化为氧阴离子，并在高pH 值下被高效阴离子交换柱分离。目前，反相固相萃取（reversed-solid phase extraction，SPE）与HPAEC-PAD 联合用于多糖分析和检测掺假蜂蜜[7]。SPF 在浓缩蜂蜜多糖的同时，可以有效消除干扰性单糖和少量低聚糖。可见，HPAEC-PAD 是检测极低浓度蜂蜜掺假的灵敏技术。

3.2.5 超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术

四级杆高分辨质谱（Q-TOF-MS）通过质量分离和测量全产物离子来识别化合物，该技术具有高灵敏度和高准确性[8]。Q-TOF-MS 在全扫描或产品离子扫描模式下操作，可以同时对未知污染物、代谢物和降解产物进行敏感的识别和定量。近年来，超高效液相色谱-飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF-MS）被广泛应用于蜂蜜中不同类型碳水化合物掺假的检测，如二果糖酐、2-乙酰呋喃-3 吡喃葡萄糖苷等。

3.3 光谱技术

3.3.1 核磁共振

利用质子核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）结合统计模型可以对来自不同地理来源的单花和多花蜂蜜进行鉴别。通常，先采用独立成分分析检测所有蜂蜜（纯蜂蜜和掺假蜂蜜），进而采用联合近似特征矩阵对角化算法从核磁共振信号中提取相关信息。总的来说，核磁共振波谱可以快速检测蜂蜜中的掺假物，以及从一个光谱中同时定量各种化学化合物。然而，与其他许多高端分析技术一样，核磁共振的高运行成本以及对现场专家人员的要求限制了其广泛的应用。

3.3.2 红外光谱

红外光谱技术现已成为常用的蜂蜜掺假检测技术之一。由于该技术检测速度快、样品制备方法简单、成本低、无损、用户友好以及适用于真实现场监测等优势，备受广大用户青睐[9]。红外光谱存在两个区域测量：近N-IR（10000 -4000 cm-1）和 中M-IR（4000 -450 cm-1），M-IR 用于监测基本振动，N-IR 提供信息的高频复泛音和重叠的振动峰，M-IR 的光谱峰比N-IR 更窄，分辨率更高。通常，红外光谱用于准确识别C3 和C4 植物中广泛存在的掺杂物。

3.3.3 拉曼光谱

拉曼光谱是基于单色光（激光）与分子电子云相互作用时发生能量交换（极化率变化）的原理。拉曼效应发生在入射光非弹性散射时，导致由分子键振动态模式控制的波长偏移，呈现出分子结构的独特表达[10]。拉曼光谱实际上是红外光谱数据的补充信息，当与化学计量学结合使用时，可以提供蜂蜜中不同掺假糖的高精度定量检测。

3.3.4 化学计量学集成红外光谱技术

红外光谱已经成为与化学计量分析相结合的最常见的光谱方法，并已成为检测蜂蜜掺假的有力工具，该技术已经成功用于对不同植物来源采集的蜂蜜进行准确的定性和定量区分，并量化蜂蜜中各种糖的浓度，对C3 和C4 型蜂蜜中的掺假糖进行分类时具有高度准确性。目前普遍认为，化学计量集成红外光谱技术的使用有利于开发准确可行的系统，适用于大量蜂蜜样品的高通量筛选和定期监测。

3.4 生物传感器

一般来说，各种分析技术不能检测分析蜂蜜的物理特性（如嗅觉、味觉、温暖、凉爽、不透明度、透明度、色彩等）。与人类嗅觉相比，GC-MS 可以检测到挥发性化合物，但却无法鉴别挥发性化合物。随着生物传感器的发展，在一定程度上克服了这一缺点。电子鼻（e-nose）通过差异选择性聚合物电位传感器来检测不同化合物散发的气味。结合模式识别模型的电子鼻技术现已被广泛用于各行业，包括食品、生物医学、植物疾病检测等。同样地，电子舌（e-tongue）作为一种分析味觉的装置已被用于味觉筛选，该设备中的传感器被设计用来模拟人类舌头上的味蕾，与食物、饮料分子相互作用，来评估食物的真实性。目前，电子鼻和电子舌分析已被广泛用于区分不同植物和地理来源的蜂蜜。

4 不同技术的比较分析

与光谱技术相比，传统的色谱技术耗时长，高度依赖于熟练的操作人员，价格昂贵，但其准确性和可靠性是无可争议的，目前最先进的SPE-HPAEC-PAD 技术识别蜂蜜掺假水平的最低检测限（LOD）已达1%。由于光谱技术操作简单，检测迅速，通常在检测蜂蜜中的杂质时更加实用，但除NMR 外，单独的光谱技术如拉曼光谱、红外光谱等无法识别掺假标记物，所以往往与化学计量学数据分析相结合，以提取相关信息。核磁共振在检测蜂蜜掺假方面是非常优秀和可靠的，但其高昂的价格和对熟练操作人员的要求限制了它的适用性。总之，光谱和色谱技术都不适合蜂蜜中掺假物的快速、高通量检测和定量。目前，生物传感器（电子鼻、电子舌等）是简单、快速和准确地检测蜂蜜中不同类型掺假物的最有前景的技术之一，通过将化学计量学数据分析与生物传感器输出特性相结合，可以对蜂蜜样品进行现场准确和大规模的质量检测筛选。

5 展望

本文综述了蜂蜜中掺假检测和定量的几种方法的过去的发展、趋势、未来的潜力和优缺点，蜂蜜行业可以利用检测手段的快速发展来确保蜂蜜的安全和质量。虽然检测假蜂蜜的技术不断取得进展，但必须加紧开发新的和先进的分析方法，以便适应快速发展的蜂蜜产业。目前来看，可以通过化学计量集成光谱技术，如拉曼光谱和红外光谱，以及生物传感器技术来精确地确定和量化蜂蜜的纯度。事实上，通过生物传感器监测蜂蜜质量应该是着重发展的方向，这是因为该技术无污染、样品制备简单，并且检测结果精准。