石油污染土壤生物修复技术研究进展

2023-03-12杨全毅李宏伟刘亮德刘熙阅底国彬

化工机械 2023年5期

杨全毅李宏伟刘亮德王娟刘熙阅底国彬

（中国石油工程建设有限公司华北分公司）

石油作为重要的能源和化工产品，被誉为现代工业的血液。然而石油工业中勘探、采油、炼化及储运等环节往往会对油区和周边生态环境带来负面影响。研究表明，每生产1 t 石油就有约2 kg 石油污染物进入环境，油区工作范围20 平方千米的土壤均会不同程度受到石油污染［1］。土壤是生态环境极为重要的组成部分，也是人类社会赖以生存的珍贵资源，土壤中的石油污染物除其本身的生物毒性外，还会严重影响土壤结构与功能，进而危害环境安全、农产品产量和安全以及人类健康。石油污染土壤的修复和治理是亟待解决的世界性环境问题之一。近年来，全球石油污染场地修复案例中，生物修复技术因具有比传统理化修复方法多的优势，已获得愈加广泛的应用，并被认为是治理大面积石油污染土壤最具实际应用价值的技术。

1 石油污染土壤生物修复技术概念与分类

微生物和植物是石油污染土壤生物修复技术中最为常用的生物。利用微生物进行石油污染土壤修复，可分为原位修复和异位修复两类主要方法。原位修复即在污染现场进行修复，对土壤结构扰动小、工程量小，适合较大规模的场地修复。异位修复需要将受污染土壤转移至合适地点或生物反应器中，通常用于石油污染程度高但面积较小的污染场地，相比原位修复可避免污染物扩散，并可以通过对降解条件的控制缩短修复周期，提高修复效率。

1.1 微生物原位修复技术

1.1.1 生物强化

生物强化（Bioaugmentation）可分为培养土著微生物的生物培养法和引入外源微生物的投菌法。生物培养法是定期向石油污染土壤中添加营养物质和电子受体（如氧或双氧水等），以满足土壤中原有土著微生物的生长需要，提高其对石油污染物的降解能力。投菌法是将定向筛选驯化培养的外源微生物接入石油污染土壤中，并添加其生长所需营养物质，通过外源微生物对石油污染物的降解达到修复土壤的目的。

由于土壤中的土著微生物在土壤受石油污染的过程中已逐渐对污染物产生耐受，因此相比外源微生物往往具有更高的适应性［2］。从对污染物耐受性高、降解效率高、不影响当地环境多样性的土著微生物中筛选强化获得的高效石油污染物降解菌，目前在石油污染土壤生物修复技术中广泛应用［3］。

1.1.2 生物通风

土壤中微生物对石油污染物的自发降解通常会使土壤中的氧气减少，因此对土壤强制曝气的生物通风（Bioventing）法可促进微生物降解石油污染物的生物过程。该方法通常会在通入空气时适量添加氮、磷等元素，以提高土壤中微生物的降解活性。这种方法可看作土壤气相抽提技术与微生物降解技术的结合。

该方法的局限性在于只适用于多孔结构、渗透性好、不饱和的污染土壤，不适用的土壤结构在运用该方法过程中会导致氧气与营养元素在污染物未完全降解前就已被完全消耗，从而使修复效率受到影响［4］。

1.1.3 生物耕作

生物耕作（Biofarming）法指在石油污染土壤中适当施肥灌溉并定期进行人工或机械搅拌，使石油污染物与土壤中微生物、营养物质和空气充分接触，尽可能为微生物降解提供良好生长环境，从而增强微生物的代谢活性，促进土壤中石油污染物的降解。生物耕作法通常适用于污染程度较低的浅表层土壤污染，并常常与植物修复方法联合使用，以提高修复效率。

1.2 微生物异位修复技术

1.2.1 预制床法

预制床法（Prepared Bed）是在构建的防渗平台上铺垫砂石后，再平铺150～300 mm 的石油污染土壤，加入营养物质和水，必要时可适量添加表面活性剂等，同时定期翻动土壤为微生物生长提供充足的氧气，促进微生物对土壤中石油污染物的降解［5］。

1.2.2 土壤堆肥法

土壤堆肥法（Composting Pile）是将污染土壤从污染场地挖掘运输到经过防渗处理、设置通风管道等工程准备的场地堆放，使用多项强化措施（补充水分、控制通气量、添加营养物质或土壤调理剂等）来保证适宜的堆体环境以促进微生物生长代谢，从而提高微生物对污染物去除效率的修复方法。其中肥料、农业废弃物及木屑等均可作为调理剂加入到污染土壤中，以提高土壤营养物质含量和渗透性。该方法常用于污染程度较高和难降解有机物含量较高的石油污染场地修复中，研究证明该方法具有良好的修复效果［6，7］。

1.2.3 生物反应器

生物反应器（Bioreactor）法又称生物泥浆法，指挖掘出的石油污染土壤与水混合后形成泥浆，将该泥浆接入石油降解微生物，置于生物反应器内，在对生物降解过程严格控制的条件下对污染物进行处理的修复方法。该方法以水相作为处理介质，使微生物、营养物质、溶解氧和污染物在反应器内均匀分布且充分接触，传质速度加快，因此往往可获得很好的修复效果，修复周期较短。但该方法对处理设备有一定要求，且因增加了能耗和物料处置、固液分离、水处理等过程，使得工程成本增高，不适用于面源性石油污染土壤的修复治理。

1.3 植物修复技术与微生物-植物联合修复

石油污染土壤的植物修复（Phytoremediation）除植物自身对土壤中污染物的降解富集外，植物生长过程中根系分泌的营养物质、酶等活性物质为土壤微生物提供了良好的生存环境，从而促进微生物生长，提高微生物的污染物降解活性。植物修复属于原位修复技术，对土壤扰动小，修复成本低，但受植物生长周期和外界环境影响较大，往往修复周期较长。

目前植物修复常与微生物修复技术联用，通过植物与其根际微生物菌群的协同和联合作用，强化对土壤中石油污染物的降解和吸收。近年来多项研究表明，相比仅依靠植物修复，微生物-植物联合修复石油污染土壤的修复效果和周期均具有明显优势［8，9］。

2 高效土壤石油污染物降解微生物

2.1 微生物的筛选

自然界中具有石油污染物降解能力的微生物数量约占环境总微生物数量的1%，当环境中石油污染物过量存在时，可刺激对其具有降解能力的微生物数量增加到环境微生物总量的10%［10］。通过富集和选择性培养从石油污染土壤中进行分离筛选是获得高效石油污染物降解菌的传统微生物学方法。目前国内外已获得石油降解菌，包括细菌、真菌、放线菌共约100 余属，200多种。土壤中最常见的石油污染物降解细菌包括：无色细菌属（Achromobacter）、不动杆菌属（Acinetobacter）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、节杆菌属（Arthrobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、黄杆菌属（Flavobacterium）、微球菌属（Micrococcus）、分支杆菌属（Mycobacterium）、诺卡氏菌属（Nocardia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、红球菌属（Rhodococcus）等。最常见的石油污染物降解真菌包括：曲霉属（Aspergillus）、假丝酵母属（Candida）、被孢霉属（Mortierella）、毛霉属（Mucor）、青霉属（Penicillium）、红酵母属（Rhodotorula）、掷孢酵母属（Sporobolomyces）、木霉属（Trichoderma）等［11］。

除传统微生物学方法外，利用分子生物学和基因技术对土壤中石油污染物降解微生物进行基因水平的研究，可克服传统方法对土壤中“不可培养”微生物分离鉴定的限制，更为全面深入地了解微生物的丰度、多样性和结构动态变化。例如VASCONCELLOS S P 等的研究中，通过建立宏基因组文库（metagenomic clonelibrary）筛选具有石油烃降解能力的菌株，通过高通量分析（high throughputassays）从31 000 个基因克隆中筛选出72 个具有十六烷烃降解能力的克隆，后通过气相色谱-质谱联用分析（GC-MS）对21 d 培养中十六烷烃降解率进行测定，获得5 个对十六烷烃降解率超过70%的高效克隆［12］。由此可见，目前多种分子生物学技术在微生物筛选过程中的综合运用大幅提高了从环境中获得高效功能微生物菌株的效率和准确性。

2.2 微生物的驯化

经筛选获得的微生物菌株和菌群通常需要在实验室条件下针对其石油烃降解能力和环境适应能力进行进一步的驯化加强。菌种驯化指通过人工措施使微生物逐步适应特定环境条件，以提高微生物对环境的耐受性，对环境中某些特定物质的分解、转化、利用能力，或对某些代谢产物的生产能力。彭德的研究表明，在对石油污染降解菌株的14 d 适应性驯化培养过程中，菌体数量（cfu/mL）增加了100 倍左右，适应性得到了显著的提高［13］。郑瑾等在利用不同组分原油逐级驯化筛选高效石油烃降解菌的研究中，由于稠油中含有较高组分的胶质和沥青，稠油的高黏度在一定程度上会抑制微生物的生长，降低微生物对原油的降解率［14］。而相比只通过稀油驯化获得的混合菌群，经稀油和稠油两种不同组分原油逐级驯化得到的混合菌群对稀油和稠油的降解率分别提高了12.5%和22.0%，混合菌群对石油重质组分的适应性、耐受性及其对原油中大分子组分的降解能力均获得提高。石油污染场地环境的复杂性和石油污染物的难降解性，决定了对菌种和菌群进行适应能力、降解能力的驯化是石油污染土壤生物修复微生物制剂研发过程中十分必要的过程。

2.3 菌群的构建

石油由饱和烷烃、芳香烃、沥青及胶质等多种物质构成，石油污染物的降解过程是众多微生物及其所产生酶的共同作用，目前尚未发现能够降解所有石油组分的单一菌种。微生物菌群在石油污染物的降解过程中发生一系列酶促反应，同时降解多种石油组分；此外菌种之间通过协同作用互利共生，促进整体生长代谢与降解活性的提高。赵硕伟等对7 株高效降解石油微生物菌株进行研究表明，7 株菌株对石油不同组分具有不同降解能力，由其中4 种菌株组成的复合菌群在5 d 培养中对石油的降解率达70%左右，高于任何单一菌株和其他组合菌群［15］。RAHMAN K S M 等从Bambay High 原油污染土壤中存在的130 多种石油降解菌中筛选出由假单胞菌属、棒状杆菌属、微球菌属、黄杆菌属和芽孢杆菌属菌株组成的优势菌群，该菌群在20 d 培养中对1%浓度的石油污染物降解率可达到78%，显著高于单一菌种41%～66%的降解率［16］。POI G 等在新加坡地区应用由假单胞菌属、芽孢杆菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属、无色杆菌属、短杆菌属等22 种细菌组成的复合微生物制剂对2 500 t 总石油烃含量在7×103～6×105mg/kg 范围内的石油污染土壤进行修复，研究结果显示经过17 周（119 d）处理后，发现各污染物浓度类型土壤中总石油烃含量均降到1 000 mg/kg 安全范围内，并在3 年后的检测中达到7～35 mg/kg 的极低浓度，实现良好修复效果［17］。

然而，目前我国石油污染土壤生物修复工程中所使用的微生物菌群多为随机组合，外源微生物与土著微生物之间可能存在拮抗作用，导致修复效果欠佳。例如何云馨对从天津港筛选的复合石油烃降解菌进行研究时发现，添加复合菌剂时饱和烷烃和芳香烃的降解率显著低于不添加菌剂时的自然降解率29.82%和76.89%，这是由于外源微生物与土著微生物之间的拮抗作用会导致其相互抑制，进而使修复效果下降［18］。因此，在石油污染土壤生物修复技术中，因地制宜构建合适的高效石油污染物降解菌群是保证修复效果和效率的关键。

3 石油污染土壤生物修复特种植物

目前国内外已报道能够促进石油污染物降解的植物有40 多种，包括玉米（Zeamays L.）、紫花苜蓿（Medicago sativa）、向日葵（Helianthus annuus）、黑麦草（Cloliumperenne）、蓖麻（Ricinus communis L.）、碱蓬（Suaeda glauca）、高羊茅（Festuca ovina）等［19］。我国石油污染土壤植物修复虽起步较晚，但已有多项研究证明其可行性。如李先梅等对华北油田石油污染土壤植物修复的研究中，选取墨西哥玉米草（Purus frumentum）、苏丹草（Sorghum sudanense）、黑麦草和紫花苜蓿4种牧草植物进行不同石油污染水平下成活率、生物量和石油去除率的测定，发现墨西哥玉米草和苏丹草的根系发达，生长过程中对石油污染危害的调节能力强，其成活率、株高、生物量受石油污染浓度影响均较小，且具有较高的石油去除率，适合作为该区域石油污染土壤修复植物［20］。李春荣在陕北地区石油污染场地以玉米、向日葵、苜蓿、大豆为修复植物进行的连续两年原位修复试验表明，150 d 可以使土壤中初始质量浓度为10 000 mg/kg的石油烃分别降解42.5%、46.4%、44.7%、40.6%；500 d 分别降解95.5%、96.1%、92.4%、87.6%，修复效果明显［9］。赵首彩等在陇东地区石油污染地块用当地牧草紫花苜蓿作为供试植物进行田间试验，结果显示种植苜蓿地块的石油污染物去除率为90.07%～96.10%，是空白对照组的1.6～5.2 倍，证实了紫花苜蓿对当地石油污染土壤具有很好的修复效果［21］。

4 石油污染土壤生物修复条件优化

石油污染土壤生物修复的效果受到土壤性质、污染物浓度、土壤中营养物质含量等多种因素影响，通过对修复条件的优化可促进微生物与植物的生长，提高生物修复效果。在制约石油污染物生物降解的环境因素中，土壤的气体渗透率、含水率和土壤中营养物质的成分与含量是最主要的因素。

4.1 土壤气体渗透率

由于用于生物修复的微生物大多属于好氧型微生物，且植物根系生长也需要土壤具有良好的孔隙度与透气性，因此翻耕、添加膨松剂、设置通风设施等方式均可通过增加土壤氧气供给提高修复效率。董亚明等在使用混合菌对克拉玛依地区稠油污染土壤进行修复研究时发现，每隔两天翻耕1 次的频率结合添加稻壳作为膨松剂，经过70 d 的生物修复，石油烃降解率最高可达54.07%，是不翻耕且不添加膨松剂对照中石油烃降解率的2.35 倍［22］。

4.2 土壤含水率

微生物与植物生长均需要适宜的水分作为保证，过高或过低的含水率会对土壤中生物的生存造成胁迫。土壤中水分含量过高时，水会将土壤孔隙中的空气替换出来，造成缺氧环境，不利于好氧微生物与植物的生存；土壤中水分含量过低时，营养微生物传质速度低，也使得水流作用力迁移的微生物的生长较不利。通常石油污染土壤生物修复的适宜土壤含水率在25%～30%范围内［23，24］。

4.3 土壤中的营养物质

碳、氮、磷是微生物生长过程中必不可少的重要营养元素。在石油污染土壤生物修复过程中，通过添加营养盐、肥料、农业废弃物等方式合理补充土壤中的氮、磷有利于提高微生物降解率，同时也可促进修复植物的生长。樊鹏军等研究表明添加营养物质同时接种高效石油污染物降解微生物可使降解率比自然条件下提高近50%，仅添加营养物质而不接种外源微生物也可使降解率比自然条件下提高约25%［25］。国内外多项研究均获得与上述研究一致的结论，即接入高效石油污染物降解微生物的同时添加营养物质，可获得比仅添加外源微生物或仅添加营养物质更好的石油污染物降解效果［23，26～28］。

美国国家环保局（U.S.EPA）公布的数据显示，多数条件下土壤石油污染物降解微生物生长需要的最佳碳∶氮∶磷比例为100∶10∶1［29］。然而由于石油污染土壤生物修复过程中土壤性质、污染物成分和含量、所使用微生物和植物种类差异的复杂性，适宜的营养元素种类和添加量需根据实际情况进行设定。

5 石油污染土壤生物修复效果评价

土壤中石油污染物的含量是生物修复效果最直接的判断依据，然而该单一指标并不足以全面评价生物修复的效果，尤其对土壤生态功能的修复应使用生物指标进行评价。

土壤中微生物的数量和多样性是土壤生态功能的体现，同时可在一定程度上反映微生物对石油污染物的降解能力［24］。此外，随着石油污染物的降解，土壤毒性降低，土壤中微生物种类变得丰富。杨茜等的研究显示，生物修复后土壤细菌群落结构多样性指标辛普森指数（Simpson’s diversity index）和香农指数（Shannon’s diversity index）分别从2.95 增加至3.33，从0.84 增加至0.88，生物多样性显著提高［30］。

土壤酶活性也常被用作石油污染土壤生物修复的评价指标。脱氢酶具有氢中间传递体的作用，可作为评价微生物降解石油烃能力的指标；多酚氧化酶可将土壤中的芳香族化合物氧化成醌，促进石油降解，因此是体现微生物对石油中芳香烃类物质降解能力的指标；过氧化氢酶能促进过氧化氢分解为水和氧气，是一种土壤毒性指标［31］。此外，土壤修复前后植物的种子发芽率、平均生长指数、生存率、生物量、叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性等也常作为评价土壤生物毒性和生物修复效果的指标［32，33］。