皂角刺不同部位高效液相色谱特征图谱及化学模式识别

2023-03-11王瑜婷黄贵发何荣荣黄醒鹏黎桃敏孙建焱陈江平

化学分析计量 2023年1期

王瑜婷，黄贵发，何荣荣，黄醒鹏，黎桃敏，孙建焱，陈江平

（1.广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东佛山 528244；2.浙江一方制药有限公司，浙江金华 321000）

皂角刺为豆科植物皂荚的干燥棘刺，味辛，性温，归肝、胃经，始载于《本草衍义补遗》，具有消肿托毒，排脓，杀虫的功效[1-2]。皂角刺资源丰富，主要分布在我国河南、山东、河北等地。现代研究表明，皂角刺主要含有黄酮类、三萜类、酚酸类、香豆素类化合物，其中黄酮类化合物是其主要活性成分。花旗松素是皂角刺中含量较高的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤、神经保护、改善心肌细胞纤维化等作用[3-6]。

2020 年版《中国药典》一部中皂角刺的质量标准仅规定了药材的性状、显微鉴别和薄层鉴别，没有含量测定和特征图谱检验项，难以有效地控制皂角刺药材整体质量。中药特征图谱能较全面系统地反映中药整体化学成分的特征信息，是目前公认的最适合中药物质群质量控制的手段之一[7]，因此笔者采用高效液相色谱（HPLC）法建立皂角刺不同部位（主刺根、支刺根、刺尖）的特征图谱，运用方差分析、热图和聚类分析、主成分分析等化学模式识别方法对其HPLC 特征图谱进行统计分析，同时测定皂角刺不同部位的花旗松素含量，以期为皂角刺药效物质基础及质量控制研究奠定基础。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Waters Arc 型，沃特世科技（上海）有限公司。

电子天平：（1）XP26 型，感量为0.001 mg；（2）ME204E型，感量为0.1 mg，瑞士梅特勒托利多仪器（上海）公司。

超纯水系统：Milli-Q Direct 型，德国默克密理博公司。

高速中药粉碎机：111B 型，浙江瑞安市永历制药机械有限公司。

数控超声波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司。

HWS28型恒温水浴锅：HWS28型，上海一恒科技有限公司。

花旗松素对照品：批号为111816—201102，质量分数为98.9%，中国食品药品检定研究院。

香草酸对照品：批号为110776—201503，质量分数为99.8%，中国食品药品检定研究院。

槲皮素对照品：批号为100081—201510，质量分数为99.8%，中国食品药品检定研究院。

乙腈、甲醇：色谱纯，德国默克公司。

甲酸：色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

其它试剂均为分析纯。

实验用水为超纯水。

皂角刺药材样品：编号为S1～S12，经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定为正品，均为豆科植物皂荚的干燥棘刺，产地为河南、河北。

1.2 样品制备

皂角刺主刺根、支刺根、刺尖示意图见图1。按照图1将12批皂角刺药材的主刺根、支刺根、刺尖分离，得主刺根（编号：A1～A12）、支刺根（编号：B1～B12）和刺尖（编号：C1～C12）。

图1 皂角刺主刺根、支刺根、刺尖示意图

1.3 溶液配制

1.3.1 对照品溶液

香草酸、花旗松素、槲皮素混合对照品溶液：分别取香草酸、花旗松素、槲皮素对照品适量，精密称定，用70%（体积分数，下同）的甲醇溶解、稀释、定容，制成各目标化合物的质量浓度分别为14.571、100.696、24.551 µg/mL的混合对照品溶液。

花旗松素对照品溶液：198.631 µg/mL，取花旗松素对照品适量，精密称定，用70%甲醇溶解、稀释、定容。

1.3.2 样品溶液

取样品粉末（过3号筛）约1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，称取质量，加热回流45 min，取出，放冷，再称取质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.4 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry 柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm，美国沃特世公司）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），流量为1.0 mL/min；梯度洗脱程序：0～5 min 5%～13% A，5～20 min 13%～16% A，20～45 min 16%～20% A，45～50 min 20%～25% A，50～65 min 25% A，65～80 min 25%～40% A；柱温：25 ℃；检测波长：260 nm；进样体积：5 µL［3，8-9］。

1.5 实验方法

采用色谱峰面积标准曲线法对皂角刺中花旗松素定量。采用方差分析、聚类分析、主成分分析法对皂角刺不同部位各特征峰进行化学模式识别分析。

2 结果与讨论

2.1 样品制备方法

分别对样品的提取方式（超声法、回流法）、提取溶剂（50%、70%、100%甲醇，50%、70%、100%乙醇）、提取时间（30、45、60 min）及溶剂体积（25、50、100 mL）进行考察，结果表明加入70%乙醇25 mL，回流45 min已提取充分，各特征峰的响应值和分离度均较好，因此采用1.3.2样品溶液制备方法。

2.2 检测波长

采用PDA检测器对样品溶液进行全波长扫描，比较波长在190～400 nm时的色谱图数据，结果表明在260 nm时色谱峰信息较丰富，故波长用260 nm。

2.3 专属性试验

分别精密吸取混合对照品溶液、空白溶液及样品溶液，在1.4色谱条件下测定，色谱图见图2。

图2 专属性试验色谱图

由图2 可知，样品溶液色谱在与对照品溶液色谱相应的保留时间处具有相同的色谱峰，且空白溶剂无干扰，表明该方法专属性良好。

2.4 线性关系

精密吸取花旗松素对照品溶液，加入70%甲醇稀释制成系列质量浓度的花旗松素对照品溶液，按1.3项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以对照品溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，绘制标准工作曲线。花旗松素的质量浓度线性范围、线性方程及相关系数见表1。由表1可知，花旗松素的质量浓度在9.932～198.631 µg/mL范围内与色谱峰面积具有良好的关系。

表1 花旗松素的线性范围、线性方程及相关系数

2.5 精密度试验

精密称定主刺根粉末（编号A12）6 份，按1.3.2方法制备样品溶液，按1.4色谱条件进样测定，试验结果见表2。由表2可知，测定结果的相对标准偏差为0.95%，表明该方法精密度良好。

表2 精密度试验结果 %

2.6 稳定性试验

取主刺根粉末（编号A12），按1.3.2方法制备样品溶液，分别于制备0、4、8、12、24、48 h后按1.4色谱条件进样测定。以首次测定花旗松素色谱峰为参照峰，各特征峰相对峰面积、相对标准偏差列于表3。由表3可知，各色谱峰相对峰面积基本不变，表明样品溶液在48 h内稳定性良好。

表3 稳定性试验色谱峰相对面积

2.7 加标回收试验

取已知花旗松素含量的主刺根样品粉末，精密称取9 份，每份约0.5 g，置于具塞锥形瓶中，分为3组，每组分别精密加入相当于花旗松素含量50%、100%、150%的花旗松素对照品溶液，按1.3.2 方法制备样品溶液，按1.4色谱条件进样测定，计算加标回收率，试验结果见表4。由表4 可知，花旗松素的平均加标回收率为88.10%，表明该法准确度较高。

表4 样品加标回收试验结果

2.8 特征图谱的建立

取12 批主刺根、支刺根和刺尖样品，按1.3.2 方法制备样品溶液，按1.4色谱条件进样测定，记录色谱图。采用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012 版”对色谱图进行匹配，分别以样品A1、B1 和C1 的色谱图为参照图谱，时间窗宽度为0.1 min，通过多点校正、全谱峰匹配分别生成对照特征图谱R1、R2、R3，确定皂角刺主刺根、支刺根和刺尖均有8 个相同的共有峰。通过与对照品图谱对比，确定3 号峰为香草酸，7 号峰为花旗松素，8号峰为槲皮素。

2.9 化学模式识别分析

2.9.1 方差分析

采用SPSS 26.0 统计分析软件，以12 批共36 个样品各特征峰的单位峰面积（峰面积与取样质量比值）为变量进行单因素方差分析，结果见表5。

表5 12批主刺根、支刺根和刺尖HPLC特征图谱共有峰的方差分析结果

由表5可知，与主刺根比较，支刺根、刺尖的峰2均有显著性差异（P＜0.05）；与刺尖比较，主刺根、支刺根的花旗松素、槲皮素均有显著性差异（P＜0.05），表明峰2对应化合物、花旗松素、槲皮素是导致皂角刺不同部位质量差异的主要成分。由于槲皮素峰面积较小、含量低，故只测定了花旗松素含量。

2.9.2 热图和聚类分析

采用热图（HemI） 1.0 软件，以12 批主刺根、支刺根和刺尖共36 个样品各特征峰的单位峰面积为变量进行热图和聚类分析[10]。聚类分析结果显示，36 个样品可以分为3 类，A1、A2 聚为一类，A3～A6、A8、A10～A12、B2、B4、B5、B11 聚为一类，C1～C12、B1、B3、B6～B10、B12、A7、A9 聚为一类。除A1、A2、A7、A9外，主刺根与刺尖可以分为两类，支刺根分散在主刺根和刺尖类别之中，无法较好地聚类，表明主刺根和刺尖的质量差异较明显。

2.9.3 主成分分析

采用SPSS 26.0软件，对12批主刺根、支刺根和刺尖共36个样品各特征峰峰面积进行主成分分析，结果显示KMO＞0.5，Bartlett 检验P＜0.01，表明各峰面积适合做主成分因子分析［11-12］。当特征值大于1 时，共提取3 个主成分因子，其特征值和方差贡献率见表6。旋转后主成分因子载荷矩阵见表7。

表6 主刺根、支刺根和刺尖主成分分析特征值及方差贡献率

表7 主刺根、支刺根和刺尖旋转后主成分因子载荷矩阵

由表6、表7 可知，前三个主成分累积贡献率为83.192%，表明提取的3个主成分能反映皂角刺特征图谱的大部分信息。主成分1的特征值为3.696，方差贡献率为46.197%，载荷较高的峰有峰2、花旗松素、槲皮素，表明这3个峰主要反映主成分1的信息；主成分2的特征值为1.872，方差贡献率为23.403%，载荷较高的峰有峰1、峰4、峰5、峰6，表明这4 个峰主要反映主成分2 的信息；主成分3 的特征值为1.087，方差贡献率为13.592%，载荷较高的峰有香草酸，表明香草酸主要反映主成分3的信息。

2.9.4 综合评分

根据表6 和表7 的数据，由公式Fi=a1X1+a2X2+…….+aj Xm（a为特征值，由成分矩阵中的第j列载荷除以对应成分特征值的算术平方根所得［13-14］；Xi为各单位峰面积的标准化值），计算得到主成分得分F1、F2、F3，主成分得分图见图3。

图3 皂角刺主刺根、支刺根和刺尖HPLC特征图谱主成分得分图

36 个样品可以分为2 类，再根据综合评分函数F=F1×0.461 97+F2×0.234 03+F3×0.135 92（其中F1、F2、F3为3个主成分的得分，系数为各成分的方差贡献率），计算得到皂角刺不同部位HPLC特征图谱的综合评分，结果见表8。从各部位综合得分的排名情况可知，排名前10的样品中，刺尖有6批，支刺根有4 批；排名倒数10 名的样品中，主刺根有6 批，支刺根有3批，刺尖有1批。总体来说，同一批次皂角刺药材的刺尖品质最优，支刺根居中，主刺根最差。

表8 皂角刺主刺根、支刺根和刺尖综合得分排名表

2.10 含量测定

分别取12批主刺根、支刺根、刺尖样品，按1.3.2方法制备样品溶液，按1.4色谱条件进样测定，计算花旗松素的含量，结果见表9。由结果可知，12批皂角刺药材不同部位的花旗松素含量均为刺尖＞支刺根＞主刺根，说明花旗松素主要富集于刺尖。结合热图分析结果中刺尖部位的花旗松素、槲皮素颜色较主刺根、支刺根偏暖，花旗松素和槲皮素均为黄酮类成分，推测黄酮类成分主要富集于刺尖，黄酮类成分为皂角刺主要活性成分，因此，为保证临床疗效，应保证药材不同部位的完整性，另皂角刺在煎煮过程中应进行合理的前处理确保刺尖部位有效成分的溶出。