细胞焦亡在针刺抗脑缺血再灌注损伤中的研究进展

蔡理,姚锃钰,杨路,许秀洪,罗梦,周国平,

(1.南方医科大学中医药学院,广州 510515;2.南方医科大学中西医结合医院,广州 510315)

脑血管病是全国第一大、全球第二大致死性疾病,其高发病率、高病死率和高致残率使其成为目前最为威胁人类健康的疾病之一,严重增加社会负担[1-2]。随着老龄化的进展,我国缺血性脑梗死发病率也正在逐年上升[3]。大脑缺血一定时间后血液再次恢复供应,其功能不仅未能恢复,反而出现了更加严重的脑功能障碍,称为脑缺血再灌注(cerebral ischemia reperfusion, CIR)损伤[4]。CIR后神经元损伤是由多种机制参与的一种复杂的病理生理过程,多种环节因素之间又互相作用。细胞焦亡是近年来发现并证实的程序性细胞死亡方式,其发生伴随炎症反应,是CIR后神经元损伤的重要形式之一[5]。减轻细胞焦亡及炎症反应的发生有助于 CIR后大脑损害,是卒中防治机理研究的热点[6]。针刺是临床治疗缺血性卒中的有效方法,大量研究表明,针刺能改善 CIR损伤,减少神经元死亡[7]。为了进一步阐明针刺治疗脑缺血中风病的机理,为临床治疗提供思路,本文就近年来针刺抗卒中病涉及细胞焦亡及相关标志物的研究作一综述。

1 细胞焦亡概述

细胞焦亡被描述最早可追溯到 198 6年,Friendlnnder等发现炭疽致死性毒素可使小鼠巨噬细胞死亡,并伴随胞内物质快速释放,但这种不同于凋亡的细胞死亡方式并未引起当时学界的重视[8]。直至2001年, GALLUZZI L等[9]发现细菌感染的巨噬细胞经历了依赖半胱氨酸天冬酶-1(Caspase-1)活性的快速裂解细胞死亡后,细胞焦亡一词才被正式定义。细胞焦亡的形态学特征、发生及调控机制等均不同于凋亡、坏死等其他细胞死亡方式。研究表明,焦亡细胞在形态上同时具有凋亡和坏死的特征,其形态学特征为核碎裂、核溶解;细胞膜渗透性增高,细胞肿胀破裂,引起胞内物质和促炎因子释放,如白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白介素-18(interleukin-18, IL-18)等,诱发炎症反应[10-11]。进一步的研究发现细胞发生焦亡时,细胞膜有1～2 nm的小孔形成,正是这些小孔使细胞内的离子平衡丧失,水分内流,细胞肿胀继而膜破裂,细胞发生渗透性溶解[11]。

上述细胞焦亡的形态学特征是由Caspase-1介导产生的,内源性和外源性的刺激信号通过不同途径激活 Caspase-1,Caspase-1继而将无活性的 IL-1β、IL-18前体裂解为具有活性的炎症细胞因子,激活其他免疫细胞,诱导其他炎症细胞因子、趋化因子、黏附分子等的合成,放大局部和全身炎症反应,形成“级联效应”[12-13]。因此,Caspase-1对细胞焦亡的形成起决定性作用,已证实在大鼠短暂性脑缺血后,皮质及海马CA1区锥体神经元IL-1β在缺血3 h表达最显著,且动态变化与脑水肿变化时间一致,应用 Caspase-1抑制剂YVAD-CMK可显著减少脑组织IL-1β的含量,减轻脑水肿,改善缺血性脑损伤[14]。炎症小体(inflammasome)是一种多蛋白质复合物,它的组装可以导致Caspase-1被激活。在识别外源性或内源性病原相关分子后,Nod样受体家族(Nod-like receptor, NLRs)部分成员发生自身寡聚化,在接头蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)的衔接下与 Pro-Caspase-1连接形成活化的小体,从而把无活性的 Caspase-1剪切为有活性的Caspase-1[15-16]。其中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白 3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)是NLR蛋白家族中细胞焦亡中的主要炎性复合物,可对多种刺激进行应答,具有整合多种类型的危险信号从而使 Caspase-1活化的能力,是脑缺血后中枢神经系统无菌性炎症反应的始动因子,在中枢神经系统中诱导细胞焦亡和炎症反应[17]。除上述途径,还有一类为依赖Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11的非经典途径。在革兰氏阴性菌等信号刺激下,活化的Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11切割gasdermin D(GSDMD),诱导细胞膜穿孔破裂,释放内容物并引起炎症反应[18]。细胞焦亡是机体重要天然免疫反应,在拮抗感染和内源危险信号中起着关键作用。大量研究[19-21]表明,Caspase-1广泛参与了感染性疾病、神经系统疾病、动脉粥样硬化性等疾病的发生发展,并在其中发挥了重要作用。

2 细胞焦亡与CIR损伤

CIR损伤的病理生理过程非常复杂,目前的研究主要认为涉及该过程的机制主要有自由基损伤、炎症反应、线粒体功能障碍、细胞自噬、钙超载等[22]。炎症反应的发生贯穿 CIR的整个过程,动物实验证实发生CIR的脑组织中IL-1β、IL-6等炎症因子呈高表达,对神经元的损伤起到重要的作用[23]。脑缺血发生的早期,缺血区脑血流速度减慢,中性粒细胞黏附至血管内皮细胞启动炎症反应,血流恢复供应后,外源性炎性细胞透过血脑屏障到达脑缺血区,形成继发性低灌注,大量氧自由基开始释放;另一方面,中枢神经系统中的星形胶质细胞诱导小胶质细胞活化、增殖,产生大量炎症介质,增加兴奋性氨基酸毒性,进一步释放氧自由基[24-25]。在这些内源/外源性刺激下,多个炎症信号转导通路被激活,促使NLRP1、NLRP3等寡聚化,通过接头蛋白ASC与相关受体结合并招募Pro-Caspase-1从而形成炎症小体,而 Caspase-1前体又能被炎症小体裂解,使其变成活化的 Caspase-1最终诱导细胞发生焦亡,同时放大炎症反应,加重脑缺血再灌注损伤[26]。

此外,有研究表明,CIR发生时线粒体的过度分裂将导致自身功能发生障碍,异常线粒体与氧化酶结合产生大量氧自由基,激活NLRP3等炎性小体,并为炎性复合体的组装提供平台,从而激活 Caspase-1并诱导细胞焦亡的发生[27]。而在脑缺血再灌注的中晚期,大量细胞自噬性死亡,细胞内容物释放并激活 NLRP3等炎性小体,也能诱导周边细胞发生坏死或焦亡[28]。总之,作为伴随炎症反应而产生的细胞焦亡在CIR的病理生理过程中发挥重要作用,并与其他机制密切相关,脑缺血后 NLRP3、ASC及 Caspase-1等蛋白表达均有所升高,IL-1β、IL-18等炎症因子呈高表达,而敲除NLRP3基因或使用Caspase-1抑制剂可显著减少神经元死亡,改善缺血再灌注损伤[29-30]。

3 细胞焦亡在针刺抗CIR损伤中的研究

临床上针灸治疗中风病具有良好的效果,闫志刚等[31]对靳三针治疗中风后痉挛性偏瘫进行研究,发现针刺能提高中风后运动功能与日常生活活动能力,康复训练的基础上配合针刺治疗能进一步提高偏瘫患者肢体恢复能力;楚佳梅等[32]证实电针刺激脑平衡区对提高偏瘫患者站立平衡功能、改善其步行能力有较好的帮助。刘宪印[33]对头三针联合体针治疗缺血性卒中后认知障碍进行研究,结果表明针刺促进了中枢胆碱能神经系统中乙酰胆碱的分泌和合成,从而改善患者的认知功能和记忆功能。此外,针灸对改善中风病患者吞咽障碍、睡眠障碍、抑郁等诸症都有较好的疗效[34-35]。大量基础研究也显示针刺干预能显著改善CIR后的神经功能缺损症状,降低脑梗死面积,减少神经细胞死亡等,其中关于抗神经元损伤的研究主要集中在细胞凋亡、自噬及坏死[36-37],但对细胞焦亡这一近年新发现并证实的细胞死亡方式的研究报道尚少。

3.1 针刺抗CIR损伤后伴随炎症反应的相关研究

细胞焦亡的发生伴随炎症反应,而炎症反应是脑缺血损伤的重要机制。大量研究显示针刺抗CIR后损伤大的作用机制和减轻炎症损伤有关,其中也包括针刺对 NLRP3等炎性小体和IL-1β、IL-18等炎症因子的调控作用。张亚敏等[38]发现,针刺百会和足三里可下调大鼠外周血清IL-1β和IL-6的表达,以24～48 h最显著,提示针刺可抑制脑缺血损伤早期炎症反应并延缓组织损伤。卞炜等[39]发现电针百会、合谷和太冲可抑制大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)大鼠皮质区嘌呤能受体P2X7R(purinergic 2X7 receptor,P2X7R)/NLRP3表达,减少小胶质细胞数量,并下调IL-1β、IL-18等炎症因子含量从而减轻脑缺血再灌注损伤。ZHANG T等[40]研究显示针刺能抑制卒中各时期炎症小体NLRP3和ASC的表达及相关炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6的释放,减轻脑组织水肿和神经性炎症,发挥脑保护作用。此外,针刺可能对不同炎症因子存在双向调控,方晨晨等[41]研究发现,电针可以通过增加IL-4表达量,降低TNF-α表达量,提升 IL-4/TNF-α的比值从而发挥抗炎作用,抑制缺血再灌注区的炎症反应,减小脑梗死体积并促进神经功能恢复。上述研究证明针刺可减轻脑缺血后的炎症反应,同时对诱导细胞发生焦亡的炎症小体和级联效应下游的炎症因子具有调控作用,为针刺抗细胞焦亡的可能性提供了理论依据,但遗憾的是并未对细胞焦亡这一细胞死亡方式做过多探究。

3.2 针刺抗 CIR损伤后神经细胞焦亡调控因子的相关研究

Caspase家族是细胞焦亡的关键调控基因,通过敲除Caspase-1基因或使用Caspase-1抑制剂能有效降低细胞焦亡,减轻卒中损伤,故Caspase-1在实验研究中常被作为细胞发生焦亡的标记物[42-43]。最新的研究显示,针刺可直接对 Caspase-1等细胞焦亡调控因子进行调控,减少神经细胞焦亡发生从而改善 CIR损伤。许秀洪等[44]发现,电针足三里、三阴交、尺泽和合谷可下调MACO大鼠海马区Caspase-1的mRNA及蛋白水平,改善CIR损伤,HE染色显示电针干预后发生焦亡的细胞数量减少。董苗苗等[45]发现电针可减少 MACO大鼠神经元和小胶质细胞死亡,并下调 Caspase-1、IL-1β、IL-18及 TNF-α表达,电镜下观察到海马区神经细胞发生焦亡减少。刘昱麟等[46]则通过眼针干预CIRI大鼠,发现其能够抑制缺血半暗带区 IL-1β、IL-18及 P2X7R、NLRP3、Pro-Caspase-1、ASC、Caspase-1的表达,减少细胞焦亡的发生并发挥抗炎作用。上述研究均提示,针刺改善CIR后神经细胞焦亡的机制可能是通过细胞焦亡产生的经典途径,即对NLRP3/Caspase-1的调控。但对于依赖 Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11诱导细胞发生焦亡的非经典途径,或下游执行蛋白 GSDMD等针刺干预可能存在的调控机制,相关的研究报道尚少。

此外,细胞焦亡作为一种促炎性的细胞死亡方式,在多种疾病的发生发展过程广泛参与,其他研究者的发现中,也指出了针刺疗法对细胞焦亡存在的抑制作用。李晓宁等[47]通过夹脊电针干预急性脊髓损伤模型大鼠,发现夹脊电针能够使大鼠脊髓组织NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1表达下降,且在术后3、7 d两个时间点最显著,提示夹脊电针可能发挥了抑制 NLRP3炎症小体过度活化,降低Caspase-1表达,减缓细胞焦亡的作用。李海波等[48]采用电针刺激急性肾损伤大鼠双侧足三里和肾俞,发现其能降低肾小管上皮细胞焦亡率,下调肾皮质Caspase-1、IL-1β及其mRNA表达。ZHANG Y等[49]研究发现,持续4周的电针治疗显著改善了由慢性不可预测应激引起的抑郁样行为,抑制了NLRP3炎性体组分表达和小胶质细胞激活标志物Iba-1的增加,并同时下调了IL-1β、TNF-α、IL-6表达。这些研究再次证实了针刺这一干预手段对细胞焦亡可能存在调控作用,且不局限于脑缺血病。

4 小结与展望

针刺是抗 CIR损伤的有效治疗手段,但其具体作用机制尚未阐明。细胞焦亡这一新近发现并逐渐被学界重视的神经细胞死亡方式,其发生依赖 Caspase家族的激活并同时伴随炎症反应。目前的研究证实,针刺干预能下调 Caspase-1及相关炎症因子的表达,发挥抗炎作用并改善CIR损伤,但尚不能完全揭示其机理。首先,针刺穴位的选择未能统一,相关研究多采用百会、合谷、足三里等,或单穴位进行治疗,横向可比性较低。其次,治疗窗口期是影响针刺调控CIR后细胞焦亡的关键,不同研究选择进行针刺干预时间点,以及干预次数和持续时长其产生效果的差异性需进一步分析。最后要指出的是,目前研究对细胞焦亡发生的信号通路缺乏整体研究,并在细胞形态学检测上未能予以重视,后续实验可从这些方面进一步探索研究,以期揭示针刺的神经保护作用机制,并为临床治疗脑缺血病提供理论依据。