m6A修饰在胶质瘤中的研究进展

郭岩松 李思柔 李琳 曾昭穆 白泽通 温稀超 郑克彬

河北大学附属医院神经外科（河北保定 071000）

胶质瘤是中枢神经系统肿瘤，主要来源于神经胶质细胞，约占所有原发性脑和中枢神经系统肿瘤的28%，占所有恶性肿瘤的80%［1］。胶质瘤分为1～4 级，1、2 级为低级别脑胶质瘤，3、4 级为高级别脑胶质瘤，其中胶质母细胞瘤恶性程度最高，患者5 年生存率极低，目前临床上以手术切除辅以放疗、化疗、电场治疗等综合疗法［2-3］，但其很难彻底切除，且很容易从原发肿瘤上脱离并穿过脑组织［4］，进展快、对放化疗抵抗且有较高的复发率。为了更有效地治疗胶质瘤，有必要了解胶质瘤的发病机制以及分子生物学特性。

近年来，随着特异性抗体和高通量测序的快速发展，非编码RNA 和RNA 的转录后修饰已成为当前研究的活跃领域［5-6］。N6-甲基腺嘌呤（m6A）基因修饰作为分布最广泛的RNA 修饰，在哺乳动物中也很显著，其通过甲基转移酶（“编写者”）安装、去甲基酶（“擦除者”）消除和结合蛋白（“读取者”）识别来协调其功能［7］。m6A 修饰在包括癌症［8］在内的生理发育和病理过程中发挥着不同的作用，随着研究的深入，其在胶质瘤中所发挥的生物学作用和应用不断被发现，令我们对胶质瘤有更进一步的认识，并为胶质瘤的治疗提供新方案。

1 m6A 修饰及作用机制

m6A 修饰主要发生在共有序列RRACH（R 表示鸟苷（G）或腺苷（A），H 表示A、胞苷（C）或尿苷（U））的腺嘌呤中［9］，广泛分布于真核生物中。m6A 修饰主要由甲基转移酶、去甲基酶和结合蛋白调节，作为一种调节系统，最重要的就是其可逆性［7］。作为一种表观遗传学修饰，m6A 修饰通过调控基因表达在细胞中发挥生物学功能。

1.1 甲基转移酶（“编写者”）甲基转移酶起“编写者”作用，使m6A 沉积在RNA 上。m6A 甲基转移酶复合体是一个约1 000 kDa 的完整复合体，包含甲基转移酶样3、14 和16（METTL3/14/16）、E3泛素连接酶CBL1（HAKAI）、锌指CCCH 结构域13（ZC3H13）、KIAA1429（又称VIRMA）、RNA 结合基序蛋白15 及其类似物（RBM15/15B）和Wilms 肿瘤相关蛋白（WTAP）［10-11］。METTL3 是最早发现的甲基转移酶和甲基转移酶的核心亚基，另一个关键酶METTL14 可与METTL3 相互作用［12］，形成一个稳定的异源二聚体，表现出比单独的METTL3 更高的m6A 安装活性。结构和生化研究表明，METTL3与SAM 结合，METTL14 通过提供RNA 结合支架在结构上支持METTL3，从而提高其甲基化效率［13］。METTL16 是U6 剪接体小核RNA 的甲基转移酶，SAM 同源稳定所必需的。WTAP 是甲基转移酶复合体的第三亚单位，在哺乳动物中与Wilms 肿瘤1蛋白结合的剪接因子，在胚胎发育中起关键作用。虽然WTAP 对RNA 靶标没有催化活性，但它可以帮助METTL3-METTL14 异源二聚体定位在核斑点中，并促进m6A 沉积［14］。在哺乳动物雌性发育过程中，RBM15/15B 的缺失导致了XIST 介导的X 染色体上的基因沉默，可作为m6A 甲基转移酶复合体的辅助因子［10］。VIRMA 招募并引导催化（METTL3/METTL14/WTAP）到m6A 甲基化的特定RNA 区域，同时HAKAI 也是组成甲基转移酶的一部分［11］。在果蝇和小鼠中，发现ZC3H13 与Fl（2）d相关复合体成分相互作用，作为甲基转移酶复合体的辅助因子，控制果蝇性别决定中m6A 的总体水平［15］。

1.2 去甲基酶（“擦除者”）去甲基酶作为“擦除者”主要参与RNA 修饰的去甲基化过程，将RNA甲基化修饰信号“擦除”。α-酮戊二酸依赖的双加氧酶B 同源物5（ALKBH5）或脂肪质量和肥胖相关蛋白（FTO）可以使m6A 去甲基化是当前所知的两种m6A 特异性去甲基酶［16］。FTO 和ALKBH5 通过酮戊二酸和位于细胞核和细胞质中的二价铁离子发挥作用，先氧化m6A 生成N6-羟甲基腺苷，然后转化为N6-甲酰腺苷（F6A）。当F6A 转变为腺苷（A）时，便完成了去甲基化过程［17］。FTO 蛋白核心区与ALKB 蛋白家族相似，但它能够使甲基化的单链DNA或RNA去甲基化，正是由于其C末端独特的长环与ALKB 家族的其他蛋白不同［18］。ALKBH5和FTO 的表达水平有所不同，在小鼠中，ALKHB5主要在睾丸和雌性卵巢中表达，相比之下，FTO 主要表达于大脑中，这可能与它们参与的各种生化途径有关［17-18］。

1.3 结合蛋白（“读取者”）结合蛋白识别和结合RNA 上的m6A 或改变RNA 的结构发挥m6A 在转录后基因修饰中的作用，并激活调控通路，如mRNA 降解和miRNA 加工，从而影响靶mRNAs 的表达［19-20］。结合蛋白包括YTH蛋白家族（YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1 和YTHDC2）、异质核核糖核蛋白（HNRNPs）和胰岛素样生长因子2 mRNA 结合蛋白（IGF2BP），它们特异性地识别和结合靶RNA 中的m6A 位点［21］。大多数情况下，m6A 读取者影响RNA 加工的分子机制，而不涉及对m6A 水平变化的调节［22］。在YTH 蛋白家族中，YTHDF1 提高了m6A 相关mRNA 的翻译效率，YTHDF2 增强了m6A 修饰转录本的降解，YTHDF3通过与YTHDF1 相互作用来调节其靶RNA 的翻译效率，并通过与YTHDF2 的协同作用来诱导RNA衰退［23-24］。

2 m6A 修饰在胶质瘤中的生物学作用

m6A 对RNA 的内部修饰被认为是自然界中最普遍和最持续的RNA 改变，m6A 相关蛋白表达水平的高低在胶质瘤中发挥不同的生物学作用，深入了解m6A 修饰在胶质瘤中的作用机制，寻找关键的靶基因，有助于胶质瘤的基因靶向治疗。

2.1 m6A 修饰参与胶质瘤的发生发展m6A 修饰不仅促进胶质瘤的发生发展，而且起到抑制作用。在胶质瘤中高表达的ALKBH5，作为m6A 擦除者使靶转录产物G6PD 去甲基化，加强其mRNA稳定性，促进G6PD 的翻译，从而激活磷酸戊糖途径，促进胶质瘤的发展［25］。此外，METTL3 通过调节关键癌基因或抑癌基因转录本部位的m6A来影响肿瘤，如在GBM 中上调的METTL3 甲基化ADAR1 并增加其蛋白水平，然后ADAR1 通过结合CDK2 起到不依赖其脱氨酶活性的促癌作用［26］。m6A 修饰相关蛋白还发挥肿瘤抑制作用，如敲除FTO显著促进pri-miR-10a的m6A修饰，并被HNRNPA2B1 识别，通过招募DGCR8 进一步促进miRNA-10a 的成熟，从而靶向肿瘤抑制蛋白MTMR3 促进GBM 细胞的恶性进展。同时发现FTO 的转录活性可被转录因子SPI1 抑制，而敲除SPI1 可恢复FTO的表达，并抑制GBM 的进展［27］。可见m6A 修饰在胶质瘤的进展中发挥着至关重要的作用。

2.2 m6A 修饰参与胶质瘤的侵袭转移胶质瘤具有强大的侵袭转移能力，可浸润邻近组织、器官，甚至向远处转移，m6A 修饰调控因子的异常表达可导致其侵袭和转移能力的改变。上皮向间充质转化（EMT）过程使细胞具有转移和侵袭特性，并使细胞获得启动转移的能力［28］。在EMT 过程中，E-钙黏蛋白（E-Cad，CDH1）的丢失和N-钙粘蛋白（N-Cad，CDh2）的上调被认为是影响细胞黏附的最关键一步，基质金属蛋白酶（MMPs）表达上调导致的细胞外基质（ECM）蛋白减少也是肿瘤侵袭的重要原因。TAO 等［29］实验表明在EMT 过程中，GBM 细胞的m6A RNA 水平较对照细胞显著下降，ALKBH5 的上调和METTL3 的下调影响GBM 细胞MMP2、CDH1、CDH2 和FN1 的水平，促进EMT 的进程，促进细胞的迁移和侵袭。此外，ALKBH5 的过表达还可以在体内加剧GBM 的EMT 进展。通过调控m6A 修饰的表达可起到抑制胶质瘤侵袭转移的能力，为GBM 的分子靶向治疗提供新的参考。

2.3 m6A 修饰参与胶质瘤的血管生成在肿瘤组织中有许多滋养血管，丰富的血供为其增殖提供了有力的营养支持，这对于低级别肿瘤向高级别转变尤为关键，而且，血管生成与肿瘤恶性程度存在显著的相关性。m6A 修饰能够参与胶质瘤的血管生成，如在胶质瘤中依赖于METTL3 的m6A修饰增强了HOTAIRM1 的稳定性，HOTAIRM1 通过上调IGFBP2 的表达促进胶质瘤细胞血管生成拟态（Vasculative Mimicry，VM）的形成，VM 可促进恶性肿瘤的血管生成，进而促进胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭［30］。此外，研究发现在颅内肿瘤免疫微环境（TIME）中，胶质瘤干细胞m6A 修饰主要分布在新生血管周围，并与血管周围病理生态协同作用，介导TIME 的免疫抑制表型，同时，聚类分析显示，m6A 与血管生成对免疫抑制有协同促进作用［31］。血管生成是胶质瘤发生、发展以及增殖的关键，m6A 修饰和血管生成之间的协同效应，为胶质瘤的血管靶向治疗带来新的方向。

3 m6A 修饰在胶质瘤中的应用

m6A 修饰不仅在胶质瘤的发生发展中起到不同的生物学作用，而且在胶质瘤的临床治疗上中扮演着重要角色，其在胶质瘤的诊疗、预后评估等方面都有不俗的表现。

3.1 m6A 修饰参与胶质瘤的诊断近些年来，随着表观遗传学的研究，m6A 修饰被认为是诊断GBM 有效的生物标志物，一些表观遗传状态确实解释了GBM 的结果。多项组学研究［32］表明，炎症水平较高、肠道微生物多样性减少的患者血清中FTO 水平显著降低。另一项研究［33］发现，外周血RNA 中的m6A 是胃腺癌的潜在诊断生物标志物。YTHDF1 作为m6A 结合蛋白，能加速m6A修饰的mRNAs 在细胞质中的翻译，在多种人类癌症中高度表达，被证实与癌症预后不良密切相关，也可作为临床诊断和治疗的分子标志物［34］。因此，对于中枢神经系统肿瘤来说，从外周血或脑脊液中鉴定m6A 修饰可能是诊断GBM 的一种有前途的方法。

3.2 m6A 修饰参与胶质瘤的治疗当前临床上对于胶质瘤多采用手术联合放化疗、电场治疗等综合疗法，但其具有很强的侵袭、转移特性，且很难从脑中完全切除，复发是难免的。研究表明将m6A 修饰作为靶点进行基因治疗能有效地抑制胶质瘤的恶性行为，从而达到治疗目的。FTO 的转录活性可被转录因子SPI1 抑制，而SPI1 的转录活性可被SPI1 抑制剂DB2313 特异性阻断，用该抑制剂治疗可恢复内源性FTO 的表达，降低GBM 的肿瘤负荷，提示FTO 可作为GBM 一种新的治疗分子靶点［27］。TANG等［35］发现ALKBH5基因的缺失显著抑制胶质瘤移植瘤的生长，挽救抗肿瘤免疫反应，增加脑脊液中细胞毒性淋巴细胞和促炎细胞因子，同时显著抑制了程序性细胞死亡配体1（PD-L1）蛋白的表达。此外，RNA 免疫沉淀测序和RNA 测序证实ZDDHC3 是ALKBH5 的直接靶标，ALKBH5缺失会损害YTHDF2 介导的ZDHHC3mRNA 的稳定性，从而通过加速PD-L1 在胶质瘤中的降解。因此将m6A 修饰作为靶点治疗，有望成为抑制胶质瘤增殖、转移、促进其凋亡的新型方案，同时联合放化疗、电场治疗有可能会有意想不到的效果。

3.3 m6A 修饰参与胶质瘤的预后评估分子靶向治疗与肿瘤电场治疗以及放化疗联合应用，可以改善胶质瘤患者的预后［3］，近年来发现m6A 修饰在胶质瘤的预后评估中发挥重要作用。研究［27］表明FTO 的表达与GBM 的恶性程度有关，但与MGMT 启动子甲基化、年龄或性别无明显相关性，Kaplan-Meier 生存分析显示，FTO 低表达的GBM 患者预后较差，生存期短于FTO 高表达者，提示FTO可作为GBM 患者的一个潜在的预后指标。另一项研究［36］发现ALKBH5 的mRNA 和蛋白在胶质瘤中表达上调，且ALKBH5 的表达与胶质瘤的分级、亚型和肿瘤类型有关，COX 回归分析显示ALKBH5是胶质瘤患者的独立预后因素，同时，ALKBH5 高表达的患者总生存期明显短于ALKBH5 低表达的患者。m6A 修饰异常表达的水平可能与胶质瘤的恶性程度、分级、亚型有关，可以作为临床上指导诊治的参考指标，但其可靠性及灵敏度有待进一步提升。

4 总结与展望

胶质瘤是严重危害患者身心健康的中枢神经系统肿瘤，尽管手术辅助放化疗、电场治疗在今天经常被使用，但大多数患者的预后仍然很差。因此，急切需要找到新的诊疗方法。近些年来，在RNA 表观遗传学领域对m6A 修饰的研究描绘出一幅m6A 甲基化受编写者和擦除者的调控，并通过读取者一起参与RNA 新陈代谢的全面图景。甲基化过低或过高都有可能导致基因的异常表达，从而在疾病中发挥不同的作用。m6A 修饰不仅在胶质瘤的发生发展中起到不同的生物学作用，而且在胶质瘤的诊疗、预后评估等方面都有着不俗的表现。但当前阶段，我们对于m6A 修饰的研究还不够深入，还不能阐明m6A 调控基因表达的基本机制、不清楚m6A 作为调控系统的本质，以及m6A沉积与其他细胞过程相互的作用。相信随着我们不断的研究，作为表观遗传学领域的一颗冉冉升起的新星，m6A 修饰有望在胶质瘤的治疗中得到广泛应用。