苍术不同部位中挥发油的资源评价研究

王兴源，张 杰，赵建华，罗思凡，王 欣，王飞娟

（陕西国际商贸学院医药学院，陕西 西安 712046）

苍术为菊科植物茅苍术Atractylodes lancea (Thunb.)DC.或北苍术Atractyl odes chinensis (DC.) Koidz.的干燥根茎，临床上可用于脘腹胀满、风湿痹痛及风寒感冒等[1]。苍术熏蒸空气能够解郁避秽，在病房、产房及手术室等均取得了满意效果，而其挥发油为杀菌的主要活性成分[2-3]。气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术常用于中药挥发油的研究[4-5]，对于苍术挥发油的提取多使用根茎部位，而其地上部分资源的利用缺乏，有待深入研究。本研究通过提取北苍术叶片和根茎中的挥发油，并对挥发油进行GC-MS 分析以及实验室抑菌实验，为实现苍术地上部分的综合利用提供实验依据。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

日本岛津GC8040 型气相色谱-质谱联用仪；BSA 323S 型电子天平为赛多利斯科学仪器（北京）有限公司生产；MH-1000 电热套于北京科伟永兴仪器有限公司购买；QE-100 型高速粉碎机购买于浙江屹立工贸有限公司；XSE105DU 型电子天平（METTLER TOLEDO）；RE2000B 型压力蒸汽灭菌锅生产于河南巩义市予华仪器有限公司；96 孔微量板；普通培养箱。

无水硫酸钠、乙醚、葡萄糖、氯化钠、氢氧化钠、碘硝基四唑紫（均为分析纯），蒸馏水。PB 及PDA 培养基。抗菌活性实验所用标准菌株冻干品由陕西国际商贸学院医药学院微生物学实验室提供。

实验用苍术经陕西国际商贸学院医药学院赖普辉教授鉴定为菊科苍术属植物北苍术的干燥根茎和叶片。

1.2 苍术挥发油的提取

将苍术叶置于装有95%乙醇中加热约30min 后干燥，以去除叶中的叶绿素。将苍术根茎430g（粉碎至20 目）及苍术叶200g 放于3000ml 的圆底烧瓶中，加入蒸馏水1000ml、重蒸乙醚200ml 蒸馏萃取4 小时，用无水Na2SO4去除萃取液中的水分并减压回收乙醚，即得淡黄色苍术挥发油，冷却后为淡黄色固体，分别放入4℃冰箱保存待用。

1.3 GC-MS 工作条件

GC8040 型GC-MS 仪，色谱柱型号：Thermo TR-5-MS 毛细管质谱柱（30m×0.25mm×0.33μm）；流动相为氦气，流量为1.0ml/min，进样口温度150℃；柱 温60 ℃，以5 ℃/min 升 至80 ℃，保 持1min，以10℃/min 升至180℃，保持3min，再以15℃/min 升至250℃，保持5min；扫描模式：采用全扫描，选择质量30～350amu，EI 方式电离，电子能量70eV，离子源温度200℃，传输线温度250℃。分析方法：通过与计算机NIST 谱库对比各色谱峰对应的质谱图定性，根据总离子流图采用面积归一法计算其相对含量。

1.4 培养基的制备

细菌培养基的制备（PB 培养基）：准确称取3g 牛肉膏、10g 蛋白胨、5gNaCl 后加适量蒸馏水，用电炉加热搅拌至其充分溶解，再加入15g 琼脂粉使其融化后加水定容至1000mL。溶液冷却至室温后，用1mol/L 的氢氧化钠调节溶液的PH 值至7.3，再将其装入不同的锥形瓶中牛皮纸封好瓶口，用高压蒸汽灭菌锅（121℃，20min）灭菌后备用。

真菌培养基的制备（PDA 培养基）：将去皮的马铃薯切成块状并称取200g，用适量蒸馏水煮沸（20～30min）后用双层纱布过滤除去杂质，再加葡萄糖20g，琼脂15g，加水定容至1000mL。待溶液冷却至室温后，用1mol/L 的氢氧化钠调节至溶液的PH 值为5.6，再将其倾倒于不同的锥形瓶中用牛皮纸封好瓶口，用高压蒸汽灭菌锅（115℃，20min）灭菌即得。

1.5 抑菌活性的测定

选择滤纸片法对挥发油的抑菌活性进行检测[6-7]。以无水乙醇作为溶剂，分别将苍术根茎和叶片挥发油配制成50mg/mL 的溶液。在无菌环境下，滴加试菌液0.1mL 于培养皿的平板表面上涂匀，并将灭菌的滤纸片（d=6mm）分别在样品溶液中浸润30min，待滤纸片充分吸收试液后取出沥干贴于平板表面中央，每个培养皿贴两个滤纸片，其中两个小纸片分别为空白对照组（无水乙醇）和挥发油溶液组。用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌各做三组平行，放置平整后轻压使滤纸片紧贴于平板表面，盖上平皿盖静置30min 后置于恒温培养箱中进行培养。37℃下培养细菌24h，28℃下培养真菌48h。最后通过肉眼观察结果并测量各组苍术挥发油对4 种供试菌种的抑菌圈直径。

1.6 抗菌实验

最低抑菌浓度（MIC）的测定：本实验在参考文献[8]的基础上稍作改动，采用微量稀释法对苍术根茎和叶片中挥发油的最低抑菌浓度进行考察。在96 孔板中，供试样品孔为第1 列至8 列，空白对照孔为第9列。每孔中加入100μL 液体培养基后，利用倍比稀释法将其分为不同稀释浓度，即浓度梯度依次为25%、12.5%、6.25%、3.13%、1.57%、0.78%、0.39%、0.20%（V/V）。将50μL 不同浓度的挥发油药液依次加入96 孔板中，其中空白对照组加入50μL 无水乙醇，并按顺序向每孔中滴加50μL 菌液，每个浓度设置3 个复孔作为平行。37℃下培养细菌24h，28℃下培养真菌48h。每孔加入0.2g/L 的碘硝基四唑紫溶液50μL，若出现紫色则表明有活菌，首次出现紫色的溶液浓度则为苍术挥发油的最低抑菌浓度。

最小杀菌浓度（MBC）的测定：采用平板转种法测定MBC[9]。依次用无菌生理盐水稀释平板未生长孔的培养物（≥MIC）20 倍后，取0.05ml 接种在琼脂平板上，并在培养箱（37℃，24h）条件培养。此时，细菌未生长区域的最小药物浓度可认为是该挥发油的最小杀菌浓度。

2 结果

2.1 苍术挥发油成分分析

在上述气相色谱试验条件下，北苍术的根茎和叶片挥发油中分离出的峰数量分别为54 个、50 个。通过NIST 谱库定性及文献资料[10]直观比较苍术挥发油成分的基峰及相对丰度等，分别鉴定出化合物50 个、47 个。通过分析面积归一法测得上述化合物在根茎和叶片挥发油总组分中的含量分别为98.4%和95.2%。

结果显示，苍术根茎和叶片中挥发油成分含量较高的均为4-联苯甲醛，八氢四甲基萘甲醇、桉叶烯和茅术醇等，但并未检出苍术酮和苍术素。研究显示，提取方法及所选溶剂的不同是影响苍术挥发油抽提成分不同的重要因素。贾春晓等[11]采用蒸馏萃取法和索氏提取法分别鉴定出苍术挥发油化合物49 种、22 种，同时以二氯甲烷、无水乙醚和正己烷为溶剂进行抽提所得成分也各不相同。本研究使用水蒸气蒸馏法提取出苍术挥发油的有效成分主要为C15等倍半萜类成分，这可能与该实验所采用的挥发油提取方式及MS 的分离条件有关。

2.2 抑菌活性分析

苍术不同部位对4 种菌种的抑制作用结果显示，苍术根茎和叶片挥发油均有一定的抑菌效果，而抑菌活性却有差别。根茎挥发油和叶片挥发油对4 种菌种的抑菌效果一致，无显著差异。其中两部位所提取的挥发油对大肠杆菌及枯草芽孢杆菌的抑制作用较金黄色葡萄球菌、白色念珠菌次之。

2.3 抗菌活性结果分析

为进一步验证不同部位的苍术挥发油抑制作用，本实验采用倍比稀释法研究其对不同试验菌种的MIC和MBC。

由此可知，两部位提取的苍术挥发油对不同菌株的MIC 结果一致，且其对G+（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）及真菌（白色念珠菌）的抑制作用较强，对G-（大肠杆菌）的作用较弱。

苍术不同部位挥发油对供试菌株的MIC 范围在0.79%～1.58%（V/V）。其中两部位提取的挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的MIC 值均为0.79%（V/V），对枯草芽孢杆菌的MIC 值为1.58%（V/V）；而其对不同菌株的MBC结果有差异，范围在1.58%～12.5%（V/V）。

3 讨论

本研究通过分析水蒸气蒸馏法提取的北苍术根茎和叶片中挥发油的成分及含量，并对其挥发油的生物活性进行初步验证。

结果表明，苍术不同部位挥发油化学成分复杂多样且以萜类成分为主，其中含量较高的均为4-联苯甲醛，八氢四甲基萘甲醇、桉叶烯和苍术醇等，这与李迎春等的研究中挥发油中的主要成分相一致[12]，说明植物与其所含化学成分有一定的相关性。而北苍术叶片中所含的挥发油成分与习用部位（根茎）的化学成分相一致且其相对含量的差异亦并不明显，提示北苍术的叶片也有潜在利用价值，为苍术药用资源的综合利用及开发奠定了一定的理论依据。

抑菌活性分析结果显示，北苍术根茎与叶片中的挥发油对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌均有抑制作用，且苍术不同部位提取的挥发油对同一供试菌种的抑制效果无明显差异。抑菌圈的大小能够反映病菌对药物的敏感度，即抑菌圈直径越大该病菌对药物越敏感。

本研究结果显示，苍术挥发油对大肠杆菌及枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径较金黄色葡萄球菌、白色念珠菌小，提示苍术根茎与叶片中的挥发油对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的抑制作用较强，对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的抑制作用较弱。

抗菌活性的实验结果表明，不同部位的苍术挥发油对不同菌株的最小抑菌浓度结果一致，对实验所选用的4 种菌株均有明显的抑制和灭活作用。其中，以G+及真菌的抑制作用较强，这也与金诗凤等、施绮云等利用苍术作为空气消毒剂的研究结果相同[13-14]。由于北苍术挥发油化学成分的复杂多样性[15]，本实验仅验证了其部分抗菌的生物活性，抗菌杀菌实验有待进一步研究。

综上，提取的苍术根茎及叶片挥发油的化学成分相一致，且苍术叶片亦具有抑菌抗菌活性，为苍术全珠资源的开发利用奠定了理论基础。而本研究仅采用水蒸气蒸馏法提取了不同部位苍术挥发油，后续亦可通过不同提取方法及溶剂萃取分离出不同的苍术挥发油成分，并选用不同的菌种进行相应的活性研究，以期为苍术的综合利用及资源开发提供参考。