基于P53、Bax、Caspase-3基因表达探讨竹节参水提取物对宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响

陈红梅 冯强 黎娟 陈铁民

(儋州市中医医院，海南 儋州 571700)

宫颈癌是较为常见的生殖器官癌症〔1〕，其严重危害女性身体心理健康。目前，临床宫颈癌治疗以手术及放化疗为主，但由于化疗药物的神经毒性、关节肌肉疼痛、脱发等毒副反应及耐药问题，使其临床应用受到了一定限制〔2〕。现阶段，宫颈癌的发病年龄逐渐年轻化〔3〕，死亡率也日益见长〔4〕，这给宫颈癌的防范与治疗带来更大的挑战。目前，越来越多的研究发现，中草药在宫颈癌的治疗中发挥着积极作用〔5〕。竹节参又名竹节三七、竹节人参、白三七，为五加科植物竹节参(Panax japonicus C.A.Mey.)的干燥根茎,属《中国药典》多年收载的中药材品种〔6〕。竹节参属温性药材，味道甘中带苦，能够补肾益气，还可以消散瘀滞、缓解疼痛、收敛止血、清肺化痰〔7,8〕，常用于大病初愈、产后亏虚、咳嗽上痰、跌打损伤者〔9〕。药理学分析发现〔10〕，竹节参具有抗炎、延缓衰老、降血糖及抗肿瘤作用。皂苷是竹节参的主要活性成分(约占 23.6%)，且三萜类皂苷具有较高含量，具有解热、抗菌、抗癌等生物作用。竹节参具有较低的毒副作用，临床使用时不宜产生耐药性，且对恶心肿瘤具有良好的疗效〔11〕，但是其与宫颈癌的相关研究较少，作用机制也不明晰。本研究基于P53、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3基因表达探讨竹节参水提取物对宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响。

1 资料与方法

1.1细胞、仪器 宫颈癌HeLa细胞；MCO-AC型CO2细胞培养箱；EPICS XL流式细胞仪；5910型高度冷冻离心机；Imagephoto图像处理软件；倒置荧光显微镜；PCR仪；DAPI staining solution。

1.2药材 竹节参购自种植基地，经专家鉴定为正品。把竹节参的根茎烘干蒸发掉水分后进行碾压，收集粉状后加入纯净水回流提取3次，将获得的滤液进行浓缩，即为竹节参水提取物，提取率为25.8%，加入达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)培养基依次制成0、50、100、150 μg/ml浓度，分别为A、B、C、D组。

1.3细胞培养 取第3代培养的宫颈癌Hela细胞，0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)进行消化，调整细胞浓度为1×105/ml，接种在96孔细胞培养板中，每孔100 μl，于37℃、5% CO2培养箱中至单层细胞。将 0、50、100、150 μg/ml浓度竹节参水提取物分别加入宫颈癌Hela细胞中(100 μl/孔)，每种质量浓度设置5个复孔，将培养板放置在37℃、5% CO2培养箱中，连续进行24 h培养。

1.4HeLa细胞增殖活力 取培养好的HeLa细胞，挪至96孔板，A、B、C、D组各添加10 μl相应剂量竹节参水提取物后加入噻唑蓝(MTT)液，黑暗条件下静置4 h后除培养基，加二甲基亚砜150 μl，震荡后进行计算。

1.5HeLa细胞凋亡率 取A、B、C、D组细胞，消化后将细胞密度调至2 × 105ml，挪至96孔板，每孔200 μl，放入培养箱中24 h，滴加TUNEL检测液(含TdT酶2 μl、荧光标记液48 μl)，避光孵育，荧光显微镜下观察细胞情况，测定OD值，每张图片取5个视野，在400倍下完成凋亡细胞核计数，获得凋亡率。

1.6HeLa细胞周期 将生长良好的HeLa细胞浓度调整至1 × 105个/ml，接种至6孔板，24 h后更换培养基，48 h后加0.25%胰蛋白酶消化悬浮(无EDTA)，收集细胞。磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次，加3 ml乙醇(经-20℃预冷)，混匀后与-20℃冰箱静置1 d。测定前离心10 min(1 500 r/min，PBS冲洗2次，重悬于200 μl 0.1 mmol/L EDTA 溶液中，30 min避光孵育后加入35 μl 2% Tritonx-100、114 μl 150 μg/ml碘化丙啶(PI)溶液，充分混合后避光反应10 min，测定细胞周期。

1.7HeLa细胞凋亡形态 A、B、C、D组细胞离心10 min后去除上层清液，加入10 g/L苏木素-伊红(HE)染色液，避光10 min后去除染液，PBS 洗涤2次后涂片，晾干后在荧光显微镜下观察形态。

1.8P53、Bax、Caspase-3 mRNA表达 提取P53、Bax、Caspase-3 RNA，RT-PCR测P53、Bax、Caspase-3 mRNA表达，引物序列P53：正义链5′-GCCAGTCTGATTTGTGGGCC-3′，反义链5′-GCCAGTTGTTTTTC TGCCAC-3′；Bax：正义链5′-GACTCCAAGCGCTGA GAATG-3′，反义链5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′；Caspase-3：正义链5′-TCCAGGCCGTATAG ATCCTFFTACA-3′，反义链5′-TCCAGGGCCGTATAGATATGGTACA-3′；β-actin：正义链5′-GGCACAC TCCAAGCGCTGAG-3′，反义链5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。设定PCR条件为30℃，10 min；42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min，连续进行35个循环，最后在72℃下完成10 min延长。扩增产物放入1.5%琼脂凝胶中电泳，完毕后采用UVP凝胶图像完成灰度值的测定，以β-actin为内参。

1.9统计学分析 采用SPSS23.0软件进行F检验。

2 结 果

2.1HeLa细胞增殖活力及凋亡率 A、B、C、D组细胞增殖活力随竹节参水提取物浓度增加而逐渐减弱(P<0.001)；A、B、C、D组细胞凋亡率随竹节参水提取物浓度增加而逐渐上升(P<0.001)，见图1、表1。

图1 HeLa细胞凋亡率

表1 HeLa细胞增殖活力

2.2HeLa细胞周期 随着竹节参水提取物的浓度增加，Hela细胞G0/G1期显著增加，S期显著下降(P<0.001)，见表2。

表2 Hela细胞周期变化

2.3HeLa细胞凋亡形态 A组未添加竹节参水提取物，HeLa细胞细胞核形态为卵圆状，染色也较为均匀；B组添加竹节参水提取物后，部分HeLa细胞细胞核形态改变，出现缩小和浓缩现象，荧光现象也增强；C、D组细胞因提取物浓度增加，细胞核形态改变加剧，荧光亮度攀升，细胞核边缘破碎，见图2。

图2 HeLa细胞凋亡形态(HE染色，×400)

2.4各组P53、Bax、Caspase-3 mRNA表达 P53、Bax、Caspase-3 mRNA表达随竹节参水提取物浓度增加而显著增加(均P<0.001)，见表3，图3。

表3 各组P53、Bax、Caspase-3 mRNA表达

图3 各组P53、Bax、Caspase-3 mRNA表达

3 讨 论

现阶段，宫颈癌的发病率和死亡率逐渐攀升，患者也出现年轻化趋势，呈现高患病率、高致死率和低治愈率的特征〔12〕。宫颈癌的发病机制较为复杂，与免疫功能低下、过早性行为、多个性伴侣、吸烟、多孕、多产等都有关。现阶段，临床常用的治疗宫颈癌的手段还是手术，同时患者可能接受放疗或化疗治疗，虽然对这种治疗方式对宫颈癌患者起到了一定的效果，但也存在一些局限性，手术切除后，部分患者可能出现病情复发，无法彻底治愈，远期生存率较低等问题，而放化疗则会出现复副作用大，患者不耐受以及耐药性等问题〔13〕。近年来，多数研究人员发现中药对于肿瘤的预防和治疗具有较好效果，且副作用小，所以，中药治疗宫颈癌成为研究人员的研究重点。竹节参在临床常用于治疗跌打损伤、身体亏虚、咳嗽咯痰患者，是一种常见的中药材。相关文献记载，竹节参对于多种癌症具有较好的抑制作用〔14～16〕。除此之外，竹节参水提取物能抑制血管的形成，有助于增强机体免疫功能。有研究表明〔17〕，竹节参具有抗炎及潜在的抗肿瘤作用，其水提取物能显著增强机体免疫水平，能抑制肿瘤细胞的生长。

本研究结果表明，HeLa细胞的增殖活力随竹节参水提取物剂量的增加而降低，即竹节参水提取物的浓度越高，HeLa细胞的增殖活力越弱，这提示竹节参水提取物可以抑制HeLa细胞的增殖活力，王开元等〔15〕在竹节参的化学成分与药理活性研究进展中也有提到，竹节参提取物可以抑制胃癌细胞的增殖，这与本研究结果相类似。本研究结果提示竹节参水提取物能够诱导HeLa细胞凋亡，且其浓度越大，诱导HeLa细胞凋亡的能力越强，并且关于竹节参水提取物诱导癌细胞凋亡这一观点，在张莹等〔18〕关于竹节参与胃癌的研究中也有提到。本研究流式细胞仪测定结果说明竹节参水提取物多作用于细胞生长初期，这与刘滢等〔19〕研究结果相一致。本文还通过HE染色观察细胞形态，镜下观察发现，未经竹节参水提取物作用的HeLa细胞细胞核形态为卵圆状，染色也较为均匀；而经竹节参水提取物作用后，HeLa细胞细胞核形态改变，浓度越高，缩小、浓缩、荧光现象越明显，细胞核的染色质的凝聚增强，甚至部分细胞核边缘化，裂解,出现凋亡小体，这在刘滢等〔19〕研究中也有提及，证实了竹节参水提取物诱导细胞凋亡的作用。

细胞凋亡区别于细胞坏死，其过程不是被动的过程，而是主动的过程，多涉及基因的激活、表达与调控作用，是为了更好地适应生存而主动争取的一种死亡过程〔20〕。而癌细胞是种变异的细胞，与正常细胞不同，它可以无限增殖、迁移、侵袭，破坏机体平衡，导致细胞凋亡紊乱，危害患者生命安全。P53是抑癌基因，其能够促进癌细胞凋亡，阻止正常细胞发生癌变。但P53易发生突变，突变型P53起原癌基因的作用，抑制细胞凋亡并促进细胞恶性转化〔21〕。Bax 基因是细胞凋亡的促进基因，也是机体内重要的凋亡基因。Caspase-3与细胞凋亡密切相关，其容易活化，在CTL细胞杀死中占据重要位置。本研究结果提示竹节参水提取物可以增加凋亡基因表达，推进肿瘤细胞凋亡进程。