丝素纤维基聚氨酯粘附涂层改性人工韧带制备及性能测试分析

蒋 誉

(长安大学，陕西 西安 710064)

韧带损伤是体育运动中较常见的情况。特别是篮球、足球等具有冲撞性的体育运动，稍不注意，就可能导致韧带的挫伤、撕裂或断裂，若不及时处理，就可能引发相关的骨关节炎症，进而对运动员造成不可挽回的伤害。但受韧带特殊生理结构的影响，韧带受损后，自愈能力较低，因此在临床治疗的过程中，通常使用移植人工韧带，帮助韧带重建的方法。但传统人工韧带受其材料的影响，存在力学性能不足，降解速率较快，生物相容性较差的问题，使得人工韧带的使用存在很多的局域性。为解决目前人工韧带存在的问题，有学者研究了以纳米材料为修饰材料制备人工韧带的实用性，结果表明，纳米材料修饰后，人工韧带的粘附环境增加,促进细胞增殖，提供相对理想的力学强度[1]；但大部分纳米材料皆不具备可降解性，对韧带恢复造成一些影响。还有以丝素纤维为原材料，制作了可降解的仿生结构的人工韧带，并用对材料表面进行低温氧等离子体处理，增加了丝素纤维基人工韧带的细胞相容性[2]；但丝素纤维基人工韧带的力学性能无法满足膝关节的日常所需，因此需要进一步对丝素纤维基人工韧带进行改性。基于此，本文文献[2]的研究基础上，以聚氨酯-纳米羟基磷灰石为修饰材料，增强其力学性能，寻找一种适用于临床的人工韧带材料。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

主要材料：柞蚕丝(复丝),永发茧产品;碳酸钠(AR)，恒业化工产品;纳米羟基磷灰石(粒径60～80 nm),星新型碳材料;二甲基甲酰胺(DMF，AR),辉安化工;聚氨酯(PU,CP)，广源新材料科技。

主要设备：24锭高速编织机(GBG)，鸿源机械；HRD-818全自动绕纱机，南海荣钜机械；AS-24常温振荡染色机，元茂仪器；AJL-1004超声波清洗机，爱洁乐超声波自动化设备；78-1恒温磁力搅拌器，科瑞永兴化玻仪器；CT-C电热鼓风干燥箱，裕昌干燥工程；SQ-HZT-1003电子天平，顺强机电设备；ZX500TR体式显微镜，众寻光学仪器；YG004D医用纺织品多功能强力仪，中纤检测仪器设备；FD-1A-50冷冻干燥机，争巧科学仪器。

1.2 试验方法

1.2.1丝素纤维基人工韧带的成型

本文制备的丝素纤维基人工韧带主要从仿生学角度考虑，以ACL结构为参照对人工韧带进行设计。胶原纤维取向排列和ACL双束结构分别通过编织结构和2条内芯与一层外壳结构进行模拟；具体编织过程：

(1)用HRD-818型全自动绕纱机在用于编织机锭子上卷绕柞蚕丝，共24个；

(2)将卷绕了柞蚕丝的锭子依次安装在GBG型高速编织机上，编织2条“内芯”；

(3)将制作的2条内芯并列，置于编织机中央当芯纱，继续编织“外壳”，得到编织人工韧带，具体流程如图1所示。

图1 人工韧带编织流程图Fig.1 Flow chart of artificial ligament weaving

1.2.2人工韧带的脱胶处理

(1)将制作的人工韧带放入装有浓度为5%的Na2CO3溶液的锥形瓶中，确保人工韧带完全浸没在溶液中。将锥形瓶放入AS-24型常温振荡染色机中进行振荡脱胶处理，振荡速率，脱胶温度和时间分别为60 r/min、95 ℃和30 min；

(2)取出锥形瓶置于AJL-1004型超声波清洗机内进行超声清洗，清洗时间为10 min，倒掉Na2CO3溶液，在去离子水中超声清洗20 min，取出人工韧带进行搓洗，置于常温条件下晾干。

1.2.3聚氨酯-纳米羟基磷灰石复合涂层的制备

(1)在DMF中以质量分数10%溶入聚氨酯颗粒，置于78-1型恒温磁力搅拌器上匀速搅拌，直至聚氨酯颗粒在溶液内分布均匀，搅拌速率为250 r/min；

(2)将少量DMF与纳米羟基磷灰石混合，置于AJL-1004型超声波清洗机中进行超声分散，分散时间为15 min，得到均匀的纳米羟基磷灰石分散液；

(3)用注射器将纳米羟基磷灰石分散液缓慢滴加至聚氨酯溶液中，并在78-1型恒温磁力搅拌器的作用下使之分散均匀，滴加速度和搅拌速度分别为0.1 mL/s和250 r/min，得到质量分数为15%的聚氨酯-纳米羟基磷灰石分散液(N-Hap/PU)；

(4)将直径为1.2 mm的不锈钢芯棒衬入人工韧带内，确保在涂层过程中其形状不发生改变。在人工韧带上用毛刷均匀涂覆聚氨酯-纳米羟基磷灰石分散液，置于CT-C型电热鼓风干燥箱中烘干，烘干温度和时间分别为40 ℃和2 h；

(5)用SQ-HZT-1003型电子天平对烘干后人工韧带进行称重，记录涂层前后人工韧带质量变化，重复上述涂层烘干过程3次，得到聚氨酯-纳米羟基磷灰石涂层人工韧带(N-Hap/PU+SF)。具体制备流程如图2所示。

图2 聚氨酯-纳米羟基磷灰石涂层制备流程图 Fig.2 Preparation flow chart of polyurethane nano hydroxyapatite coating

1.3 性能测试

1.3.1表面观察

用ZX500TR型体式显微镜观察拍摄0～3次，观察N-Hap/PU涂层人工韧带表面差异，显微镜放大倍数为20。

1.3.2力学性能

(1)断裂拉伸性能：用多功能强力仪对测试人工韧带样品的断裂拉伸性，测试参数结果如表1所示。

表1 强力仪测试参数Tab.1 Test parameters of strength tester

断裂强度表达式[3]：

(1)

式中:σ为断裂强度；F为断裂强力；S为样品横截面积。

杨氏模量表达式[4]：

(2)

式中:E为杨氏模量；ε为应变。

(2)弹性回复性能测试：用YG004D型医用纺织品多功能强力仪对长度为5 cm样品弹性回复率进行测定；按表1参数对样品进行预处理，然后进行极限载荷下单次急弹性回复测试，测试条件如表2所示。

表2 单次急弹性回复测试条件Tab.2 Single rapid elastic recovery test conditions

弹性回复率表达式[5]：

(3)

式中:ER为弹性回复率；L为总伸长；L′为残余伸长。

1.3.3细胞相容性

以SF织物(空白对照)、PU涂层和N-Hap/PU 涂层人工韧带进行试验。样品表面细胞活性和增殖用CKK-8试剂盒评价，细胞数量表征是通过吸光度值对产物颜色的深浅进行量化。细胞银光染色后，用显微镜观察细胞形态，评价细胞在材料表面粘附生长情况。

1.3.4降解性能

将样品置于降解液(此处为规定的无菌酶溶液)中进行降解试验，每隔3 d更换一次降解液[6]。设置取样点为0、14、28、56和84 d，去离子水冲洗3次样品，吸干表面水分置于密封袋内，置于-20 ℃冷冻24 h；然后冷冻干燥24 h。

(1)质量损失率：用SQ-HZT-1003型电子天平称量样品初始质量，然后对样品进行降解处理，在取样点取出样品后，置于恒温恒湿环境24 h，称取样品降解后质量。

质量损失率表示式[7]：

(4)

式中：w0为初始质量；w1为降解后质量。

(2)降解液 pH值变化：用笔式pH计对每个取样点降解液pH值变化进行测定和记录。

2 结果与讨论

2.1 涂层后人工韧带材料的表面形态

在人工韧带的使用过程中，需要对人工韧带进行完整涂层，隔绝组织液与蚕丝，避免蚕丝快速降解。图3为在人工韧带上涂覆聚氨酯-纳米羟基磷灰石分散液0～3次的体视显微镜照片。

图3 人工韧带显微镜照片 Fig.3 Micrograph of artificial ligament

从图3可以看出，未经过涂层的人工韧带，表面有较多的毛羽，这是蚕丝在编织过程中产生的。毛羽会增加人工韧带与骨隧道的摩擦，对腱骨愈合产生一些不良的影响，经过一次涂层后，人工韧带表面有聚氨酯附着，但整体涂层并不完整，孔洞和毛羽皆较为明显。第2次涂层后，涂层完整度有所提升，但孔洞还是存在。3次涂层后，涂层较为完整，几乎没有孔洞出现，且毛羽较为服帖，满足人工韧带使用要求。

2.2 力学性能

理想的人工韧带应与天然ACL生物力学性能相似，应在最小形变的条件下，产生较高的拉伸载荷。 图4为人的ACL在拉伸载荷下的强力-伸长曲线。

图4 ACL在拉伸载荷下的强力-伸长曲线Fig.4 Strength elongation curve of ACL under tensile load

从图4可以看出，ACL曲线主要分为脚趾区、线性区和屈服区。脚趾区为较低应力条件下，韧带内卷曲胶原蛋白纤维伸直。当胶原蛋白纤维完全伸直，继续增加应力，韧带开始进入线性区域，此时胶原蛋白发生滑移，单位应变内应力增加，进而增加了曲线斜率。应力继续增加，在此应力作用下，胶原蛋白纤维逐渐破裂，此时应力降低，曲线斜率下降，韧带也进入屈服区，直至全部胶原蛋白都发生断裂。相关参考文献表明，人的ACL极限拉力为600～2 300 N[8]。

2.2.1拉伸断裂性能

图5为人工韧带断裂强力-伸长曲线。

图5 人工韧带拉伸断裂强力-伸长曲线Fig.5 Tensile breaking strength elongation curve of artificial ligament

从图5可以看出，人工韧带涂层前后均与人的ACL的三相曲线类似。涂层后人工韧带断裂强力有所上升，且应变减小，这就证明经过涂层后，人工韧带材料的力学性能有所上升，且在较小变形条件下，承担更大的应力。这是因为编织人工韧带时，内部纱线交错排列，在轴向压力的作用下，编织角度缩小，用更多的纱线承担轴向压力，此时人工韧带整体伸长，由较大应变产生。经过涂层处理后，涂层完全包裹纱线，且纱线间孔隙被涂层填满，受轴向压力时，纱线间几乎不产生相对滑移，减小了应变作用。引入涂层材料对整体强力的提升产生积极的作用，增加了人工韧带的整体断裂强度。经过涂层后的人工韧带的断裂强度约为63.54 MPa，杨氏模量约为127.4 MPa，明显高于人的ACL，这就说明经过涂层后的人工韧带可为膝关节日常活动提供力学支撑；同时可在单位应变内提供较大应力，在较小形变的条件下，提供较高的机械强力[9]。

2.2.2弹性回复性能

图6为涂层后人工韧带的单次加载-卸载循环曲线。

图6 涂层后人工韧带的单次加载-卸载循环曲线Fig.6 Single loading unloading cycle curve of coated posterior artificial ligament

从图6可以看出，涂层后人工韧带弹性回复率为77.55%。回缩变形能力明显优于传统人工韧带，使其在植入人体后，遇较大外力使得膝关节弯曲。让韧带伸长，能够随膝关节伸直回复到原来的长度，进而维持了膝关节的稳定性。

2.3 生物细胞相容性

图7为不同样品的 CCK-8测试结果。

图7 不同样品的 CCK-8测试结果Fig.7 CCK-8 test results of different samples

从图7可以看出，同一培养时间条件下，各试件显著性差异不大。在培养初期，仅用PU涂层的人工韧带表面细胞数量相对较多，这是因为PU涂层表面较为光滑平整，对细胞粘附铺展产生积极的作用。在4、7 d，N-Hap/PU涂层细胞相容性更佳，这可能是因为释放出部分N-Hap粒子，促进了细胞的粘附和增殖。

图8为材料表面粘附细胞的荧光染色照片。

图8 样品表面粘附细胞的荧光染色照片Fig.8 Fluorescent staining photos of adherent cells on the sample surface

从图8可以看出，培养7 d后，2种材料表面细胞皆相对较多；但N-Hap/PU复合涂层人工韧带表面的细胞数量和亮度皆高于PU涂层人工韧带，这就证明经过N-Hap/PU复合涂层后，细胞生长情况更好，活性更好。同时形状也慢慢由椭圆形转变成连接较为紧密的梭形，这就证明N-Hap对细胞在材料表面的增殖和粘附起积极作用。

2.4 体外降解性能

2.4.1质量损失率

图9为降解试验中质量损失率曲线。

图9 质量损失率变化曲线Fig.9 Variation curve of mass loss rate

从图9可以看出，在试验开始7 d，样品有质量损失；在14～42 d，变化趋势为先大幅度上升，然后慢慢的趋于平衡；这可能是因为N-Hap降解导致的。在降解早期，仅有少数N-Hap暴露在样品表面，随降解过程的进行，部分聚氨酯也随之降解，使得更多N-Hap颗粒剥落，促使样品质量降解率大幅度上升；在降解中后期，N-Hap颗粒几乎完全剥落，聚氨酯降解较慢，此时，质量损失率曲线逐渐趋于平衡。当降解时间达到84 d后，质量损失率为8.2%。相关研究表明，在同等条件下，SF人工韧带70 d质量损失率为18.6%[10]。这证实涂层的存在可调控人工韧带的降解周期。

2.4.2降解液酸碱度变化

图10为降解率pH值变化曲线。

图10 降解液pH值变化Fig.10 pH change of degradation solution

从图10可以看出，降解14 d前，pH值明显下降，这是因为聚氨酯和丝素纤维降解过程中，产生了酸性产物氨基酸和小分子聚酯，使得降解液pH值有所下降；14 d后，降解液pH值有所上升，这是碱性N-Hap颗粒引起的；42 d后，整体pH值基本维持在7.0，这是因为此时人工韧带降解趋于平衡，酸性产物和碱性产物互相缓冲，让整体环境趋于中性[16-20]。这就证明本文制备的人工韧带在酶环境下，也能维持较为稳定和缓慢的降解速率。

3 结语

本文以丝素纤维为原材料，以ACL结构为参照，以聚氨酯-纳米羟基磷灰石为增强材料制备了仿生型人工韧带，并对人工韧带性能进行了系统的研究。

(1)经过N-Hap/PU3次涂层后，丝素纤维基人工韧带涂层完整，羽毛服帖，没有孔洞出现，能有效减少人工韧带与键骨的摩擦，满足人工韧带使用要求；

(2)经过涂层后，人工韧带弹性回复率高达77.55%，断裂强度为63.54 MPa，杨氏模量约为127.4 MPa，明显高于人的ACL，具备较优的力学性能和回缩变形能力，能为膝关节提供力学支撑和稳定性；

(3)涂层后人工韧带进入体内后，释放出部分N-Hap粒子，促进了细胞的粘附和增殖，细胞形状也转变成连接较为紧密的梭形，具备较好的生物相容性；

(4)涂层可调控人工韧带的降解周期。涂层后人工韧带降解84 d后，质量损失率仅为8.2%。42 d后，人工韧带降解趋于平衡，降解液pH值趋于中性，证明在酶环境下，人工韧带可维持较为稳定和缓慢的降解速率。