褪黑素调控果蔬采后保鲜研究进展

宋聪慧，郭水欢，史小强，张寒彬，吴家锴，詹丽娟,*

（1.河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002；2.郑州市蔬菜研究所，河南 郑州 450015；3.河南农业大学植物保护学院，河南 郑州 450002）

褪黑素又名N-乙酰-5-甲氧基色胺，是一种存在于生物体内的吲哚胺类化合物，因其能使某些鱼类、爬行动物和两栖动物的皮肤颜色变亮而得名[1]，于1958年首次被发现存在于牛的松果体中，具有调节动物昼夜节律、抗氧化、调控动物生长发育等作用[1]。直到1995年，Dubbels等[2]研究证实褪黑素广泛存在于番茄、黄瓜、香蕉和烟草等高等植物的叶片组织中。同年，Hattori等[3]在24 种可食性植物中也检测到褪黑素的存在，自此褪黑素在高等植物中的作用备受关注，并成为新的热点科学问题[4-5]。尤其是随着现代植物分子生物学、基因工程、测序技术、组学技术等新理论和新方法的发展和应用，植物中褪黑素的生物学功能得到全面深入研究。大量研究表明褪黑素在植物种子萌发、生长发育、成熟衰老、生物节律以及抗逆性等方面具有类似植物激素的重要调控作用[6-8]。

近年来，褪黑素在果蔬采后保鲜中的作用研究日益增多，最新研究表明褪黑素显著提高黄瓜[9]、青花菜[10]、石榴[11]、竹笋[12]等果蔬采后抗氧化酶活力，延缓其衰老进程；减少黄瓜[9]、西兰花[13]、青花菜[10]、菜心[14]等蔬菜采后叶绿素降解，维持其良好的色泽；降低杏[15]、李[16]、猕猴桃[17]、草莓[18]等果实采后质量损失率，保持果实新鲜度；激活番茄SlACS4基因表达，诱导乙烯合成，从而促进番茄果实采后成熟，提高果实品质[19]。由此可见，褪黑素能够显著延缓果蔬采后衰老进程、维持果蔬采后品质、调节相关基因表达等。已有文献主要从清除自由基、保持细胞膜完整、调控果实成熟衰老、提高抗逆抗病性方面简述了褪黑素在园艺产品保鲜中的作用[7-8,20-22]。本文采用文献列表方式，阐述褪黑素对果蔬采后呼吸强度、乙烯释放量、抗氧化酶活力等生理变化和色泽、生物活性物质含量、抗氧化活性等品质变化的调控作用，并归纳形成调控机制示意图，从物质代谢、基因和蛋白表达等方面详细深入探讨褪黑素调控果蔬采后保鲜的可能作用机制，以期为褪黑素在果蔬采后保鲜中研究和应用提供参考。

1 褪黑素在植物中的生物合成

关于褪黑素的生物合成途径已有多篇文献对其进行详细综述[23-24]，14C同位素跟踪实验证明，植物中褪黑素生物合成需要4 步反应，至少6 种关键酶参与催化完成，即：1）色氨酸被色氨酸脱羧酶（tryptophan decarboxylase，TDC）催化生成色胺；2）色胺在色胺5-羟化酶（tryptamine 5-hydroxylase，T5H）的作用下C-5位置羟基化，生成5-羟色胺（血清素）；3）5-羟色胺被5-羟色胺N-乙酰转移酶（N-acetyltransferase，SNAT）催化生成N-乙酰-5-羟色胺；4）N-乙酰-5-羟色胺在N-乙酰-5-羟色胺甲基转移酶（N-acetylserotonin methyltransferase，ASMT）和咖啡酸O-甲基转移酶（caffeic acidO-methyltransferase，COMT）的共同作用下生成褪黑素（图1）。然而，当植物在逆境或衰老情况下，5-羟色胺（血清素）会大量累积，从而激发褪黑素另外一条合成途径，即第3步中5-羟色胺会优先被ASMT和COMT共同作用甲基化生成5-甲氧基色胺，然后再在SNAT的催化下合成褪黑素（图1）[25-26]。在该合成途径中，5-羟色胺是褪黑素合成过程中非常重要的中间产物，其在植物中的合成速率要远远高于其转化生成褪黑素速率，例如在离体水稻叶片衰老过程中，大量5-羟色胺被诱导生成（565 μg/gmf），而被诱导的褪黑素生成量（262 μg/gmf）还不到5-羟色胺生成量的一半[23]。由于褪黑素生物合成的中间产物分别在细胞质、内质网、叶绿体等亚细胞组分中合成，因此，细胞器之间的交流运输效率也决定了褪黑素合成速率与水平[27]。

图1 植物中褪黑素生物合成途径[25-26]Fig.1 Melatonin synthesis pathway in plants[25-26]

关于褪黑素在植物中的合成场所（器官或细胞器）尚无明确定论，主要因为褪黑素属于小分子物质，结构中有N-乙酰基和5-甲氧基官能团决定了其既具有亲水性，又具有亲脂性，可以自由穿过质膜，在组织和细胞间移动，而褪黑素合成的中间产物在很多亚细胞器如细胞质、内质网和叶绿体都被发现，这为褪黑素的生物合成定位带来巨大的挑战[25]。目前多数研究者认为，褪黑素主要在线粒体和叶绿体中合成并转移到其他组织器官中，因为线粒体和叶绿体分别是植物呼吸作用和光合作用的场所，也是植物产生氧自由基的主要场所，为了避免或减轻氧自由基对蛋白质、细胞膜、DNA等物质的氧化损伤，植物通过合成褪黑素这种氧自由基清除剂和广谱抗氧化剂来保护自身机体免受氧化胁迫，维持正常的生理代谢[25]。然而，也有学者提出正常情况下，褪黑素在叶绿体中合成，如果该合成途径被阻断，则褪黑素合成部位由叶绿体转移到线粒体[28]。

2 果蔬中的褪黑素含量及影响因素

研究表明，果蔬中褪黑素作为一种内源抗氧化剂可以减少果蔬产品过氧化、提高品质、延长贮藏期[29]。如表1 所列，不同种类果蔬甚至同种果蔬不同品种间褪黑素含量差异较大。蔬菜中褪黑素含量范围为2～14 230 pg/gmf和7 000～28 000 pg/gmd。根茎类蔬菜中白萝卜[3,30]、生姜[3]、大蒜[30]和洋葱[30]、叶菜类蔬菜中茼蒿[3]中褪黑素含量较高，均在300 pg/gmf以上，其中生姜的褪黑素含量因测定方法不同差异较大，范围为583.7～14 230 pg/gmf。而同为根茎类蔬菜的甜菜根[2]和芦笋[3]中褪黑素含量较少，低于10 pg/gmf。茴香、芫荽和芹菜种子中褪黑素含量较高，达到7 000 pg/gmd以上[31]。和蔬菜相比，水果中褪黑素含量总体略高于蔬菜，范围为6～14 560 pg/gmd，其中核果类水果酸樱桃[32]、浆果类水果草莓[33]和葡萄[34]中褪黑素含量均超过1 000 pg/gmf；值得注意的是，不同品种甜樱桃间褪黑素含量差异很大，品种为Burlat甜樱桃果实中褪黑素含量高达224 pg/gmf，而品种为Pico Limón Negro甜樱桃含量仅为6 pg/gmf[35]。

综上可以看出，不同种类、品种果蔬间褪黑素差异较大，造成这种差异除了与提取方式和检测方法有关外，可能还与以下因素有关：1）基因型。不同种类果蔬甚至同种类果蔬不同栽培品种之间，由于基因型不同导致褪黑素含量差异很大。例如，不同品种番茄间褪黑素相差15 倍[36]，不同品种甜樱桃褪黑素含量相差高达37 倍[35]；2）栽培措施/环境。栽培方式、灌溉方法等栽培措施和环境因子如温度、光照对果蔬中褪黑素也产生较大的影响。研究表明，栽培方式和栽培环境显著影响番茄根、茎和叶中褪黑素含量，即褪黑素含量为大田栽培＞人工气候室＞离体培养[36]，这种差异可能的原因是在自然环境（大田）中，植物需要累积更多的褪黑素这种广谱的抗氧化剂来对抗如紫外线、温度波动、空气和土壤污染、病虫害等生物或非生物因子胁迫[36]；此外，光照对果蔬中褪黑素含量也有显著的影响，套袋遮荫处理能够显著降低辣椒[37]和苹果果实[38]中褪黑素含量，这可能由于遮荫处理使果实受到的光氧化胁迫下降，降低果实对褪黑素的需求量，从而使分配到果实中的褪黑素含量减少。然而，也有研究发现套袋遮荫却增加番茄果实中褪黑素含量[37]，这种矛盾的结果可能因果蔬种类、果实成熟度和当地的气候因素所致；3）成熟度、器官和部位。研究表明，果蔬生长发育成熟度显著影响褪黑素含量，例如苹果果实发育初期褪黑素含量较高，随着果实中种子的固化和果实的膨大，褪黑素水平下降，在采收前期褪黑素的水平又有所回升[38]。同一植物不同器官中褪黑素含量也不相同，一般遵循如下模式：叶＞种子＞根＞花＞果实[39]。而在同一器官的不同部位分布也不均匀，例如羽扇豆（Lupinus micranthusGuss.）叶片中的褪黑素含量叶尖＞叶中＞叶基[5]；4）昼夜节律。植物中褪黑素含量的动态变化具有昼夜节律性，即褪黑素夜间含量较高，白天降至最低。如甜樱桃中褪黑素含量在早上5点和下午2点时达到最高峰，早上高峰的出现可能是昼夜节律调控所致，下午高峰可能与光照和温度有关[35]。因此，生产上可以通过品种选育、改变/调节栽培环境因子、调整采收成熟度、采收时间等措施获得内源褪黑素含量较高的果蔬产品，从而有利于产品采后贮藏保鲜。

3 褪黑素对果蔬采后保鲜的调控作用

3.1 褪黑素对果蔬采后生理相关参数的调控作用

新鲜果蔬尤其是呼吸跃变型果蔬在成熟和呼吸高峰前乙烯含量开始增加，并出现乙烯释放高峰，从而加快果蔬成熟衰老。研究表明适宜浓度的外源褪黑素处理能够显著调控果蔬采后呼吸作用、乙烯释放、抗氧化酶活力等相关生理参数变化，延缓衰老进程，延长货架期（表2、图2）。主要表现为以下3 方面。

3.1.1 降低呼吸速率

呼吸作用是鲜活果蔬采后最重要的代谢活动，适当的呼吸作用能够维持果蔬正常的生命活动，提高其抗性，过度的呼吸作用则会消耗过多的有机物，降低果蔬品质和贮藏期。不同浓度外源褪黑素处理能显著抑制采后水果如李[16]、猕猴桃[17]、油桃[44]、桃[45]、梨[46]、大枣[47]、枸杞[48]等果实呼吸速率，推迟呼吸高峰，相似结果也在部分蔬菜如黄瓜[9,49]、青花菜[10]、香菇[50]中被证实（表2）。关于褪黑素对果蔬采后呼吸作用的调控机制尚不清楚，其可能的原因是褪黑素在结构上保持细胞器结构的完整性，维持呼吸场所-线粒体形态[9]；在底物氧化水平上降低和总呼吸强度密切相关的3 条呼吸途径即糖酵解途径、三羧酸循环途径和磷酸戊糖途径的运行，从而降低总呼吸强度；在呼吸电子传递链水平上降低细胞色素氧化途径的运行比例，同时提高交替氧化途径的运行比例[10]。

3.1.2 抑制或推迟乙烯生成

乙烯是诱导加速采后果蔬尤其是呼吸跃变型果蔬成熟衰老的主要激素。褪黑素处理显著抑制黄瓜[9,49]、青花菜[10]、猕猴桃[17]、梨[46]、大枣[47]、枸杞[48]等果蔬采后乙烯释放量，推迟乙烯高峰出现，从而延缓组织衰老和果实软化（表2）。Hu Wei等[51]研究发现不同浓度（50、200、500 µmol/L）的外源褪黑素处理均能显著抑制采后香蕉果实乙烯生成，延缓果实衰老软化，同时提高果实内源褪黑素含量，且内源褪黑素含量变化趋势和乙烯生成量相似，其原因可能是在香蕉果实成熟衰老过程中，褪黑素作为乙烯的抑制因子，需要提高水平来平衡乙烯释放量。该作者还发现无论是香蕉耐贮品种（M.acuminataL.AAA group cv.Nan Tian Huang和M.acuminataL.AAA group cv.Bao Dao）还是不耐贮品种（MusaABB PisangAwak和M.acuminataL.AA group cv.Huang Di）都受褪黑素显著的调控作用[51]。相似的结果在梨果实中也被证实，外源褪黑素显著延缓快速软化型梨品种Starkrimson贮藏期间乙烯释放，抑制正常软化型梨品种Abbé Fetel和Red Anjou乙烯生成[46]。褪黑素对果蔬采后乙烯调控机制可能是：1）抑制乙烯合成关键酶基因表达。1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase，ACS）和1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase，ACO）是催化乙烯生物合成的两个关键酶，这两个酶基因家族在调控果蔬成熟和衰老过程中起重要作用，其易受植物内源激素和外界环境等多种因素调控。研究表明，褪黑素处理显著抑制采后香蕉MaACO1和MaACS1的表达，从而抑制乙烯生成[51]；同样，褪黑素处理抑制欧洲梨乙烯合成基因PcACS和PcACO的表达，从而抑制乙烯产生[46]；2）诱导一氧化氮（NO）生成。外源褪黑素处理显著增加采后呼吸跃变型果实香蕉[51]和梨[52]NO含量，而NO则显著抑制乙烯合成关键酶ACO和ACS的表达，从而推迟或降低乙烯生成[53]，因此褪黑素和NO可能协同调控乙烯的生物合成。然而，Sun Qianqian等[19]研究发现外源褪黑素处理尽管也显著增加呼吸跃变型果实番茄NO含量，但却上调乙烯合成关键酶基因ACO和ACS、乙烯信号转导相关基因NR、SIETR4、SIEIL1、SIEIL3和SIERF2表达，从而启动乙烯合成，增加乙烯释放量，促进番茄果实细胞壁降解和成熟软化。作者推测这可能归因于褪黑素正向调控果实成熟，负向调控果实衰老。可见褪黑素对果蔬采后乙烯的调控是复杂多样的，受果蔬种类、成熟度等多种因素的影响。

3.1.3 激活抗氧化酶系统

3.2 褪黑素对果蔬采后品质的调控作用

3.2.1 褪黑素对果蔬采后色泽的影响

鲜艳的色泽是果蔬产品特有的品质特性。新鲜果蔬富含叶绿素、花青素、番茄红素和类胡萝卜素等色素。这些天然色素不仅使果蔬呈现出诱人的色彩，还具有极高营养价值，同时也是吸引消费者选购果蔬、评价果蔬新鲜程度的重要感官品质指标。色素氧化降解直接导致果蔬颜色变黄变暗，失去明亮鲜艳的色泽和商品价值。研究表明，褪黑素能够抑制果蔬采后色素降解，维持果蔬特有的色泽。例如，褪黑素处理可显著减缓黄瓜[9]、西兰花[13]、菜心[14]贮藏期间叶绿素降解，保持其良好的颜色和感官品质，延缓青花菜[10]和菜心[14]黄化，减少鲜切芒果[57]贮藏期间β-胡萝卜素的损失，保持果肉色泽，增加竹笋[12]、猕猴桃[17]和草莓[18]组织亮度，抑制猕猴桃[17]、芒果[57]和梨[58]果肉酶促褐变、增加番茄果实中番茄红素含量[59]（表2）。褪黑素调控果蔬采后色泽变化机制如图2所示，其主要原因可能是：1）褪黑素可有效保持细胞结构完整，维持线粒体和叶绿体的完整性，降低叶绿素分解[17,60]；研究发现，外源施用褪黑素显著降低中国大白菜叶绿素分解代谢和抑制脱落酸（abscisic acid，ABA）生物合成基因表达，从而降低内源ABA水平，延缓大白菜叶绿素降解和衰老黄化[60]；2）褪黑素能够抑制乙烯生成（表2），降低因乙烯诱导的果蔬组织黄化；3）褪黑素作为一种广谱的抗氧化剂能够减少果实内部ROS对细胞的氧化伤害，激活酶类抗氧化系统和非酶类抗氧化系统（表2），清除氧自由基，减少色素的氧化降解[45]；4）褪黑素通过抑制酶促褐变关键酶多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和POD活力，降低果蔬组织酶促褐变，维持良好的色泽[10,57]；5）褪黑素还上调色素合成基因表达，诱导花色苷、番茄红素等色素合成累积，维持和增强果蔬的原有色泽[59]。

3.2.2 褪黑素对果蔬采后生物活性物质及抗氧化活性的影响

新鲜果蔬中含有大量的天然生物活性物质如维生素类、多酚类、黄酮类以及胡萝卜素类。这些化合物具有较强的抗氧化活性，对人体健康起着举足轻重的作用[61]。研究表明，褪黑素作为一种新的植物生长调节剂和生物刺激剂显著正向调控果蔬采后生物活性物质和抗氧化活性（表2、图2）。不同浓度褪黑素处理均能延缓杏[15]、李[16]、猕猴桃[17]、桃[45]等果实VC含量下降，减缓草莓[18]、枸杞[48]、葡萄[55]、鲜切芒果[57]、梨[58]、石榴[62]果实VC降解，同时维持较高的总酚、类黄酮、类胡萝卜素、花色苷等抗氧化物质水平，增强果蔬组织抗氧化活性和自由基清除能力。相似的结果在蔬菜上也被证实，外源褪黑素处理显著延缓黄瓜[9]、西兰花[13]、香菇[50]贮藏期间VC降解，促进西兰花[13]类胡萝卜素和总酚积累，提高抗氧化能力；提高香菇[50]总酚含量及自由基清除能力（表2）。褪黑素对果蔬采后生物活性物质和抗氧化活性调控可能机制（图2）：1）激活苯丙氨酸代谢途径。苯丙氨酸代谢途径是植物重要的次生代谢途径，主要包括苯丙烷代谢途径和异黄酮合成代谢途径，是酚类、黄酮和花色苷等生物活性物质合成的主要途径。Pang Lingling等[63]研究发现50 μmol/L和100 μmol/L褪黑素处理均能够激活草莓贮藏期间苯丙氨酸代谢途径，上调其合成途径中关键酶基因FaPAL、FaC4H、Fa4CL、FaCHI、FaCHS和FaF3H等表达，增加花青素和酚类物质含量，且增加的花青素水平和相关基因上调变化趋势一致。蛋白组学研究也表明褪黑素处理显著上调葡萄贮藏期间苯丙氨酸代谢途径中苯丙氨酸酶（phenylalaninammo-nialyase，PAL）、儿茶酚-O-甲基转移酶、类黄酮糖基转移酶等酚类物质合成相关酶的表达，促进酚类物质的合成，同时上调VvPAL、VvCHI、VvF3H1、VvF3H2、VvF3’H等基因的表达，促进原花青素、香豆酸等酚类物质的累积[55]；2）促进芳香族氨基酸合成，为次生代谢物提供前体物质。褪黑素除了诱导酚类、黄酮类合成酶活力、上调合成途径关键酶基因表达外，还能够促进芳香族氨基酸合成，为次生代谢物的生物合成提供充足的合成前体物质。蛋白质组学研究表明，外源褪黑素处理显著上调葡萄采后芳香族氨基酸合成中莽草酸途径关键酶的表达，促进芳香族氨基酸如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的合成，为酚类和黄酮类物质的生物合成提供充足的前体物质[55]；3）诱导内源褪黑素及其合成中间产物生成。研究表明外源褪黑素处理显著诱导采后果蔬内源褪黑素水平累积[10,13,63]。累积的褪黑素作为一种具有多种功能的植物刺激素，其本身具有很强的抗自由基能力，能够通过单电子转移和氢转移作用方式对抗自由基[7]。且其具有亲水和亲脂特性，能在水溶性和脂溶性双重环境中发挥清除自由基作用，因此，褪黑素清除自由基能力甚至强于VC和VE[7]。此外，褪黑素生物合成中间产物及其衍生物如吲哚胺、5-羟色胺、N-乙酰-5-羟色胺等也都具有很强的抗氧化能力，其含量和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力显著正相关[7,64]。在褪黑素生物合成过程中，这些中间产物如5-羟色胺生成量远远高于褪黑素生成量，例如在水稻叶片过程衰老进程中，被诱导的5-羟色胺生成量约是褪黑素生成量的2 倍[23]，因此，这些中间产物对抗氧化活性也有巨大的贡献作用（图2）。

图2 褪黑素调控果蔬采后生理和品质机制Fig.2 Mechanism by which melatonin regulates postharvest physiology and quality of fruits and vegetables

表2 褪黑素对采后果蔬生理及品质的影响Table 2 Effect of melatonin on postharvest physiology and quality of fruits and vegetables

4 结语

褪黑素作为生物体内一种天然的胺类活性物质，近几十年才被发现存在于植物组织中[2]。目前研究主要集中在褪黑素对植物种子发芽、幼苗生长、逆境胁迫等生长发育过程的调控作用，其在果蔬采后贮藏保鲜中作用的研究才刚刚兴起，但发展迅速。作为天然的植物类生物刺激剂与信号分子，褪黑素对果蔬采后衰老与保鲜有显著的调控作用，其能够降低果蔬采后呼吸作用、调控乙烯释放、激活抗氧化系统、提升氧自由基清除能力、诱导生物活性物质累积，从而延缓果蔬组织采后衰老劣变，维持果蔬良好的色泽和生物活性物质水平，且具有绿色、安全、环境友好等化学保鲜剂无法比拟的优点，符合当前消费者对绿色安全、环保型果蔬产品要求，因此褪黑素在果蔬采后保鲜产业中具有巨大的潜在应用价值。

然而，作为当前新型的果蔬保鲜调节剂，褪黑素在果蔬保鲜方面的研究还处于初级阶段，主要存在以下问题：1）理论机制不明。目前文献主要研究褪黑素对果蔬采后衰老和品质相关参数的调控作用，而对其调控机制不明，尤其是褪黑素和其他果蔬成熟衰老调节剂如乙烯、NO等相互作用鲜有研究。值得一提的是，褪黑素在果蔬遭受生物和非生物胁迫中的应激作用方式不同，在生物胁迫早期，褪黑素诱导ROS生成，而在非生物胁迫或正常情况下，褪黑素抑制ROS生成[8]，这种差异应答的内在机制是什么？值得深入研究；2）技术工艺不标准，研究结果相互矛盾。现有文献对不同种类/品种果蔬原料进行研究，研究所采用的褪黑素处理浓度差异较大（1～10 000 μmol/L），且处理方法和时间也不相同，从而导致研究结果相互矛盾，例如不同类型果蔬甚至同种果蔬原料，适宜的处理浓度也不同（表2）。因此，为了能将其广泛地应用于果蔬采后产业生产，适合某种类/品种果蔬的褪黑素处理浓度和处理方式尚需进一步优化，使其标准化、规范化；3）高效快捷处理技术有待开发。目前褪黑素主要处理方式是浸泡和喷洒，不仅需要大量褪黑素溶液，增加生产成本，且耗时长、渗透吸收慢，不能满足企业生产需求。因此其他更加快捷有效的处理技术如减压渗透可能更适合商业生产，但相关研究鲜见报道；4）褪黑素需结合其他保鲜剂。当前文献主要研究褪黑素单独使用对果蔬采后保鲜的调控作用。研究表明其他类似的植物信号分子如水杨酸、NO等也对果蔬采后衰老和品质具有积极的调控作用，那么，这些信号分子如何协同/拮抗褪黑素调控果蔬保鲜？其作用机制有待研究。此外，果蔬采后在预处理、贮藏、运输、销售等贮运流通环节中不可避免地受到机械伤害、温度、湿度、光照、气体成分等关键非生物因子的影响，这些因子也可能参与褪黑素的调控作用。因此，今后研究需要根据果蔬采后贮藏运输实际情况，结合生产企业实际需求，研究褪黑素与其他因素协同作用调控果蔬采后保鲜。