基于酰基化花青素的高稳定性新鲜度可视化指示膜及其应用

张俊俊，邹小波*，宋文君，都柳孜，石吉勇*，黄晓玮，张佳凝，李志华，刘 黎

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013）

随着人们日益增加的生活需求，高品质的冷鲜肉成为消费的主流。然而冷鲜肉在贮藏运输的过程中，容易受到微生物的污染和脂肪酶的催化氧化，造成肉品的腐败变质。而腐败变质后肉品危害性大，破坏性强、难以消除，严重增加其食品安全风险[1]。指示型智能包装的开发可以实现肉品从生产到消费前的各个流通环节的品质监控，实时获取肉品的新鲜度情况[2]。因此，这种快速无损的检测方法近年来受到国内外学者的广泛关注[3-4]。值得注意的是，肉品腐败变质后会产生挥发性胺类物质，从而产生碱性的包装环境。其中，pH智能指示膜是一类通过响应环境变化后呈现可视化的颜色改变来反映肉类食品新鲜度信息的智能指示膜[5]。花青素作为一种天然提取物，在不同的pH值下有不同的颜色变化，且天然无毒，是近年来pH智能指示膜研究的重点[6]。邹小波等[7]通过优选9 种不同来源的花青素作为指示剂，制备智能指示膜，最后成功用于猪肉新鲜度的指示。Liu Jingrong等[8]以黑枸杞为指示剂，κ-卡拉胶为基材，成功制备用于虾新鲜度的指示膜。封晴霞等[9]以蓝莓为指示剂，玉米淀粉和羧甲基纤维素为成膜基材，实现牛肉新鲜度的可视化检测。众所周知，花青素在光照和温度等外界环境作用下很容易被降解，其自身不稳定性成为智能指示膜难以进一步突破的壁垒。但有研究发现酰基化的花青素可以改变花青素的空间构象，增加花青素的光热稳定性[10]。

本研究通过选取天然提取的玫瑰茄花青素（roselle anthocyanins，RA）作为来源，通过酰基化制备高稳定性的花青素，再以聚乙烯醇和环糊精作为智能指示膜的基底材料，制备高稳定性的可视化指示膜。而牛肉作为一种典型的高价值肉品，富含蛋白质和氨基酸等多种营养成分[11]。本研究以牛肉为例，研究结果旨在为酰基化花青素的高稳定指示膜在肉类食品中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜牛肉、干玫瑰茄、塑料包装盒、塑料培养皿江苏省镇江市吉麦隆超市；聚乙烯醇（mw＝1 780 kg/mol）、β-环糊精、无水乙醇、吡啶 华东器化玻有限公司；盐酸、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甘油、乙酸国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

T6U新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；RE-2000A型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；Lab-1A-50E型真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；Nicolet is50型傅里叶变换红外光谱仪美国赛默飞世尔科技公司；JSM-7800型扫描电子显微镜 日本电子Jeol公司。TA-XT2i食品物性测试仪英国Stable Micro System公司；鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；CM2300型便携式色差仪 日本柯尼卡美能达公司。

1.3 方法

1.3.1 花青素的酰基化

根据之前的研究方法提取得到RA[12]。将获得的花青素作为反应原液，乙酸作为酰基化试剂，吡啶作为催化剂，花青素、乙酸和吡啶体积比为10∶5∶1，3 倍体积的体积分数75%乙醇溶液作为溶剂，于40 ℃恒温水浴锅中充分反应4 h后取出，用真空旋转蒸发仪除去未反应的试剂，真空冷冻干燥后即可得到改性后的酰基化玫瑰茄花青素（roselle acylated anthocyanins，RAA）[13]。用pH 3的磷酸盐缓冲液将酰基化前后的花青素稀释至质量浓度50 mg/100 mL后，用于后续的实验。

1.3.2 温度和光照对花青素稳定性影响的测定

为探究温度对花青素的影响，取稀释后的花青素溶液各120 mL，分装6 份，每份20 mL，用锡箔纸避光处理后，分别置于50、60、70、80、90 ℃恒温水浴锅中各2 h，探究不同温度下花青素的稳定性；同时另取上述稀释好的酰基化前后的花青素溶液各2 份，每份20 mL分别置于室内自然光照和避光环境下，每隔2 d测量花青素的保留率，实验持续14 d，探究光照下花青素的稳定性[10]。用pH试差法测定花青素的保留率，按式（1）计算[14]。

式中：A为贮藏过程中样品吸光度；A0为初始样品吸光度。

1.3.3 酰基化花青素的紫外-可见吸收光谱测定

通过紫外-可见分光光度计测定RAA在200～400 nm波长下的紫外光谱，观察到在324 nm波长处出现了吸收峰，证明花青素被酰基化[15]；取50 μL上述稀释后的RAA溶解于4 mL pH 2～12的磷酸盐缓冲液中，测定400～800 nm波长下的紫外-可见吸收光谱。

1.3.4 指示膜的制备

取2 g聚乙烯醇溶于50 mL的100 ℃蒸馏水中搅拌至溶解；取2 gβ-环糊精溶于50 mL的55 ℃蒸馏水中搅拌至彻底溶解。再于50 ℃下将上述两者混合均匀后加入2 mL的甘油和基质干质量2%的花青素，搅拌均匀分别制得聚乙烯醇/β-环糊精/RA膜（polyvinyl alcohol/β-cyclodextrin/RA，PCR）、聚乙烯醇/β-环糊精/RAA膜（polyvinyl alcohol/β-cyclodextrin/RAA，PCRA）溶液。最后取15 mL上述溶液超声去泡后倒入塑料培养皿中，于40 ℃烘干成膜[16]。

1.3.5 指示膜的表征

1.3.5.1 膜的红外光谱测定

通过带有ATR附件的傅里叶变换红外光谱仪测定酰基化前后花青素、空白基底膜、PCR和PCRA指示膜的红外透射光谱。扫描波数为650～4 000 cm－1，分辨率为2 cm－1，扫描次数为3 次[17]。

1.3.5.2 膜的微观结构的表征

将指示膜粘贴在电镜台的侧面固定后喷金，通过扫描电子显微镜观察PCR和PCRA指示膜的截面形貌，设定加速电压为15 kV。

1.3.5.3 膜厚及机械性能的测定

指示膜的厚度通过电子数显千分尺（±0.001 m）测定，随机在膜上取3 个位置测量后取平均值。将指示膜裁剪成60 mm×20 mm长条状，设置初始拉伸距离40 mm，拉伸速率1.0 mm/s[18]。指示膜的拉伸强度（tensile strength，TS）和断裂伸长率（elongation at break，EB）分别按式（2）、（3）计算[19]。

式中：F为断裂时的最大作用力/N；S为受力的横截面积/m2。

式中：L1为断裂时指示膜的长度/mm；L0为指示膜的原始长度（40 mm）。

1.3.5.4 含水率、溶胀率、水溶性和水蒸气透过率的测定

取一定质量（m0/g）的指示膜置于温度为105 ℃鼓风干燥箱中，烘干至恒质量（m1/g），则含水率（moisture content，MC）按式（4）计算[20]。

溶胀率（swelling index，SI）和水溶性（water solubility，WS）测定：将上述干燥至恒质量的膜（m1）加入到装有20 mL蒸馏水的烧杯后，常温下搅拌24 h；取出指示膜并用滤纸擦干表面水分，测定指示膜的质量为m2。测量后再将指示膜放置于105 ℃的干燥箱中再次干燥至恒质量m3。分别按式（5）、（6）计算SI和WS[21]。

减质量法测定指示膜的水蒸气透过率（water vapor transmittance，WVP）：取完整的指示膜密封在包含20 mL蒸馏水的离心管中并用橡皮筋固定，置于含硅胶的平衡器中。每隔6 h测定离心管的质量至恒定。WVP按式（7）计算[22]。

式中：Δm为离心管减少的质量/g；x为平均膜厚/mm；t为测试间隔时间/h；S为离心管管口的截面积/mm2；ΔP为膜的内外水蒸气压差/Pa，ΔP＝3 179 Pa（25 ℃）。

1.3.5.5 膜的颜色稳定性测定

分别将指示膜置于4、25 ℃和37 ℃条件下，相对湿度为50%的恒温恒湿箱中保存。根据CIEL*、a*和b*颜色系统利用便携式色差仪测定指示膜的总色差值ΔE，其中L*值表示亮度，a*值为红绿度，b*值为黄蓝度。ΔE按式（8）计算[23]。

1.3.5.6 膜的灵敏度测定

指示膜对氨气的灵敏度响应测定方法根据先前的研究并作适当的修改[24]。首先将指示膜切成一定大小的形状并固定在自制的亚克力材料保鲜盒内部。用注射器吸0.1 mL 25 mol/L的氨水于保鲜盒，每隔一段时间拍摄指示膜的照片。最后利用本课题组开发的BMP图像识别软件，得到三通道R、G、B的颜色值，灵敏度SRGB根据式（9）计算[12]。

式中：Ra、Ga和Ba为指示膜反应前的颜色值；Rb、Gb和Bb为反应后的颜色值。

1.3.6 智能指示膜在牛肉新鲜度监测中的应用

首先将当天购买的新鲜牛肉用无菌刀具裁剪成30 g的肉块放入在保鲜盒中，尽量保证每块形状和大小相同。然后将指示膜裁剪为3 cm×3 cm的正方形固定在保鲜盒的内表面并置于4 ℃冰箱中。每天观察指示膜的颜色变化，并分别按照国标GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》[25]和GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[26]测定牛肉的pH值和挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量。

1.4 数据处理与分析

所有的实验重复3 次，数据采用SPSS 19.0软件分析，结果以平均值±标准差表示。P＜0.05表示差异性显著，所有的图表都是由Origin 2019软件（美国Origin Lab公司）绘制和分析完成。

2 结果与分析

2.1 RAA的稳定性分析结果

为了验证RAA的稳定性，对比了花青素在不同温度、光照条件下的贮藏稳定性。由图1A可以看出，酰基化前后的花青素在50 ℃下的保留率几乎没有发生变化，仍接近100%，表明此时花青素的结构未遭到破坏；而随着贮藏温度的进一步升高，RA在90 ℃下的保留率仅为57%，略低于RAA（60%）。如图1B所示，在黑暗条件下，RAA保持较高的稳定性；同时在光照作用下，RA降解加速，产生凝胶状物质，而RAA仍表现较高的保存率。有研究表明光照作用下会诱导花青素碳骨架发生改变，加速降解氧化的进程，破坏其结构[27]。而当花青素上的碳链骨架被酰基占据后，可以延缓骨架的破坏进程，减少对其亲核水攻击的暴露位点，从而增加其稳定性。综上所述，酰基化处理可以有效提高花青素的温度稳定性和光照稳定性。

图1 酰基化对RA不同条件下稳定性的影响Fig.1 Effect of acylation on the stability of roselle anthocyanins under different conditions

2.2 RAA的紫外-可见吸收光谱分析结果

由图2A可以看出，RAA的颜色从红（pH 2～5）到蓝（pH 8～10）最后到黄色（pH 11～12），这与之前研究中[28]花青素的颜色变化具有一致性，但达到颜色稳定终点需要更长的平衡时间，也进一步验证了其稳定性。如图2B所示，RAA在不同pH值下的结构改变导致颜色和吸光度发生变化：在酸性范围内，RAA溶液中的花青素结构形式主要是黄烊盐离子，对应的最大吸收波长为522 nm；随着pH值增加，花青素结构去质子化后转变为无色甲碱，红色逐渐消失；当pH值进一步增加时，诱导花青素二次去质子化形成醌型结构，最大吸收波长偏移至580 nm，花青素变成蓝紫色；pH值为11～12的极高碱性环境下，RAA发生降解；最后将红色波段与绿色波段的最大吸收峰下的吸光度的比值（A580nm/A522nm）与pH值建立模型关系，结果表明在pH值为2～8时，其比值呈线性变化，为Y＝0.136x－0.474（R2＝0.975）；但当pH值超过9后其线性关系消失，原因是花青素在强碱性的环境下直接被降解，颜色变为黄色[29]。综上，酰基化不仅可以提高花青素在不同pH值下的稳定性，同时可维持其pH敏感性。

图2 RAA溶液在pH 2～12下的颜色变化（A）和紫外-可见吸收光谱变化（B）Fig.2 Changes in color (A) and UV-vis spectrum (B) of acylated roselle anthocyanin solution at pH 2–12

2.3 智能指示膜的表征

2.3.1 指示膜的微观结构和傅里叶变换红外光谱

从图3A可以看出，PCR膜虽然表面粗糙，但没有明显的相分离结构；而PCRA膜的截面较光滑，结构更加致密（图3B）。产生该现象的原因主要是β-环糊精的主客体结构造成。β-环糊精的环外亲水和环内疏水的空腔结构造成了无论是酰基化的花青素还是未酰基化的花青素会被很好地分散到聚合物基底中，但酰基化的分散性更好可能是由于酰基化花青素更稳定，更容易负载在聚合物基底内腔中，因此出现其结构更加致密。

从图3C可以明显看出，酰基化花青素中存在3 个区域的峰位置及强度发生改变，可进一步验证花青素酰基化进程。其中第1个区域为3 336 cm－1（RA）→3 392 cm－1（RAA），对应的是花青素结构中O—H键的伸缩振动吸收峰强度增加[30]；第2个区域为2 936 cm－1（RA）→2 988 cm－1（RAA），对应的是花青素中特征结构—CH的伸缩振动加强；第3个区域为1 027 cm－1（RA）→1 073 cm－1（RAA），对应酚类分子C—C的伸缩振动吸收峰[15]。PCRA谱图中在1 738 cm－1处存在一个弱强度的峰对应为芳香环架中C＝C振动，是典型的类黄酮结构特征[31]，在含花青素的另外几条谱图中都能观察到，而空白膜中没有，表明花青素被很好地负载在基质聚合物中。空白膜在1 417 cm－1处对应为有机化合物中C—H的弯曲振动峰，该峰在各组谱图中都可以观察到。PCR膜中1 153 cm－1处对应基底材料的C—O—C的伸缩振动吸收峰[32]，且空白膜和PCRA中也存在同样相应的变化。综上，由红外光谱图可知，酰基化前后的花青素都可以很好地被负载在聚合物基材中。

图3 PCR膜（A）、PCRA膜（B）的截面微观结构和指示膜的红外光谱图（C）Fig.3 Microstructure images of cross sections of PCR (A) and PCRA (B)indicator films and their FTIR spectra (C)

2.3.2 指示膜的物理性能

从表1可以明显看出，两组膜的物理机械性能存在显著差异（P＜0.05），其中PCRA膜的TS（8.75 MPa）约为PCR膜（2.88 MPa）的3 倍，PCRA膜的EB（301%）约为PCR膜（205%）的1.5 倍，从微观结构可以看出，酰基化指示膜的结构更加致密，因此其机械强度增加。且两种指示膜的MC、SI、WS和WVP结果也存在显著差异（P＜0.05）。从图中可看出酰基化花青素的加入改善了指示膜的水稳定性。由于花青素本身存在着较多的亲水羟基，会直接降低花青素指示膜的稳定性；酰基化结构中形成的吡喃环可以减少其对水亲核攻击的敏感性，降低对水的吸附能力，从而进一步提高指示膜的稳定性，因此PCRA酰基化膜的MC和WS减小，低于PCR[33]。与此相反，PCRA的SI和WVP显著增加，分别为114.89%和2.06×10－6g/（m·h·Pa），表明酰基化后的花青素膜具有良好的水稳定性，以保证在水中仅膨胀而不破裂。同时具有较高的WVP，可以很好的用作新鲜度传感器。

表1 PCR和PCRA指示膜的物理特性Table 1 Summary of the physical properties of PCR and PCRA films

2.3.3 指示膜的响应灵敏度和颜色稳定性

酰基化前后指示膜对氨气的响应灵敏度如图4A所示，随着响应时间的延长，指示膜从开始的粉色变成蓝绿色最后变成黄色。PCR膜在响应12 min灵敏度最高，为34.50%；而PCRA膜到24 min才达到最高值，表明酰基化降低了花青素的响应灵敏度。由上述膜的物理特性可知，花青素的酰基化修饰会降低其对水亲核攻击的敏感性，同时也降低了与氨气结合的暴露位点，导致酰基化花青素基膜的响应灵敏度下降。指示膜在3 种不同温度贮藏条件下（4、25 ℃和37 ℃）的颜色变化如图4B所示，结果表明温度越高，指示膜的颜色变化越大，指示膜的稳定性越低。温度升高会造成花青素的结构改变，造成其稳定性下降。而PCRA膜的稳定性略高于PCR膜，在4 ℃贮藏条件下，10 d时的颜色变化率仅为2.59%，表现出较高的自身稳定性。

图4 指示膜的响应灵敏度（A）和指示膜在4、25、37 ℃贮藏条件下的稳定性（B）Fig.4 Color response sensitivity of the indicator films (A) and color stability at 4,25 and 37 ℃ (B)

2.4 智能指示膜应用于牛肉新鲜度的监测效果

PCRA 膜表现出较好的响应灵敏度和较高的自身稳定性，以典型的高价值牛肉为例，验证其新鲜度可视化指示功能。如图5 A 所示，指示膜的颜色变化与牛肉品质变化具有一致性。鲜牛肉的初始TVB-N含量为9.32 mg/100 g，此时智能指示膜的颜色为粉色；随着贮藏时间的延长，牛肉第5 天的TVB-N含量为14.89 mg/100 g，接近GB 2707—2016《食品安全国家标准 鲜（冻）畜、禽产》[34]的限量标准（≤15 mg/100 g），此时指示膜的粉色逐渐退化，其ΔE值为6.18；牛肉在贮藏6 d的TVB-N含量为16.81 mg/100 g，表明此时牛肉已经不新鲜，同时智能包装膜颜色变为黄绿色，ΔE值为9.07，由此可知，指示膜的颜色变化可有效反映牛肉的新鲜度。在牛肉贮藏第8天，TVB-N含量为30.89 mg/100 g，此时肉品呈现了明显的腐败气味，且指示膜的颜色变化更加明显。如图5B所示，分别将牛肉的TVB-N含量和pH值与指示膜的色差值ΔE建立模型，其中TVB-N含量线性模型（蓝色虚线）的决定系数R2为0.946 1；pH值的多项式模型（红色虚线）的决定系数R2为0.935 2，模型精度较高。因此，该指示膜可以用于实时监测牛肉的品质。

图5 牛肉贮藏期间的TVB-N含量和PCRA指示膜的ΔE值（A）及相应牛肉的pH值、TVB-N含量和指示膜ΔE值的模型关系（B）Fig.5 ΔE value of the PCRA indicator film and TVB-N content of beef during storage (A),and correlations between pH,TVB-N content of beef and ΔE values of the PCRA indicator film (B)

3 结论

本研究发现将RA酰基化后可有效提高花青素的光照和温度稳定性，同时RAA可用于肉品新鲜度指示膜的色敏材料，所制备的指示膜机械性能和贮藏稳定性增加。最后将其用于牛肉的新鲜度监测，结果显示在肉贮藏的第6天，牛肉已经开始腐败，此时指示膜颜色由粉色变为黄绿色，其ΔE值为9.07；且指示膜总色差值和牛肉品质可建立模型相关关系，为智能指示膜从实验室个体样品走向实际应用提供有效的理论指导。然而花青素酰基化后制备的指示膜灵敏度降低，因此未来可致力于探究在增加稳定性的基础上保证指示膜灵敏度的新方法。