救必应-玫瑰茄复方牙膏的抑菌功效评价

钟汉宁 余 涛 冯 娇

(东莞波顿香料有限公司，广东 东莞 523403)

引言

口腔卫生是总体健康和生活质量的根本所在，世界卫生组织将癌症、心血管疾病、龋病列为严重威胁人类健康的三大疾病。在大多数发展中国家，口腔保健知识薄弱，龋病发病率仍呈上升趋势，世界卫生组织官方网站数据显示，全世界60%～90%的学龄儿童和近100%的成年人有龋齿[1]。牙齿菌斑中的细菌尤其是厌氧菌及其产物是引起牙龈炎、牙周病的主要因素，其作为始动因子与其他因素相互联系、相互作用，影响着牙周病的发生、发展[2]。又如，细菌因素(主要是变形链球菌)在引起龋病的三大因素(细菌因素、食物因素、宿主牙齿和唾液因素)中起着核心作用，即三大因素最终都是通过细菌起作用[3]。因此，在牙膏的清洁功效中，抑菌作用的研究是所必须和重要的。

1 救必应粉末和玫瑰茄提取物的制备

1.1 救必应粉末的制备

取500g救必应原料粗粉，加入6倍重量的70%乙醇溶液，85℃加热回流提取2次，每次2 h；合并滤液后减压浓缩至适当体积，喷雾干燥即得救必应粗提物。

1.2 玫瑰茄提取物的制备

将100g玫瑰茄干粉碎，加入一定浓度的乙醇溶液，加热回流提取两次，合并两次滤液，过滤，减压浓缩至无醇味，离心取上清液加30%丙二醇后及得玫瑰茄提取物。

2 救必应-玫瑰茄复方牙膏的制备

2.1 复方牙膏的试验配方

配方见表1[4]。

表1

2.2 复方牙膏的配置

按表1组成原料的重量百分比称取各原料，将其按顺溶解，利用牙膏制膏机和真空泵进行均质乳化，最后得所需的成品膏体[5]。将其命名为样品JM0612。

3 牛津杯法抑菌实验

3.1 主要实验仪器和试剂

AIRTECH生物安全柜、BAKER RUSKINN Concept400厌氧培养箱、THERMO微生物培养箱、牛津杯(内径6mm、外径8mm、高度10mm)；脑心浸液肉汤(BHI)、BHI固体培养基(向BHI中加入1.5%细菌琼脂)、TSA+5%脱纤维羊血(血琼脂平板)。

3.2 实验方法

3.2.1 样品的制备

将2.2中所得样品JM0612称取1g用蒸馏水溶解并定容至10mL作为100%的样品液，以此100%样品液依次用蒸馏水稀释至浓度80%、60%、40%、20%、10%、5%。

3.2.2 菌悬液的制备

从-80℃冰箱里取出金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、牙龈卟啉单胞菌(ATCC BAA-038W83)、变异链球菌(ATCC25175)冻存管，放至在生物安全柜待其恢复至常温。以金黄色葡萄球菌为例，接一环即10μL出来接种至固体BHI中分离纯化，37℃培养48h。从固体BHI中挑取1个单独菌落至200mLBHI 液体培养基中， 37℃培养48h。取1mL出来到9mL浓度为0.85%的生理盐水中，稀释两次，稀释100倍，制作成约107℃FU/mL的菌悬液待用。牙龈卟啉单胞菌和变异链球菌用血琼脂平板分离纯化，用厌氧培养箱培养，其他步骤同上。

3.2.3 放置牛津杯和平板培养

溶解BHI固体培养基，恢复至46℃倾注15mL于平板中待其凝固。吸取100μL菌悬液用L型涂布棒均匀涂布在平板上。用无菌镊子夹取三个牛津杯以等腰三角形的位置放置在平板上。分别吸取200μL每浓度待测样品加入至两个牛津杯中，剩下一个牛津杯加0.85%的生理盐水作对照。同一样品两块平板平行对照。将加好样的平板于37℃培养48h后，读取结果。牙龈卟啉单胞菌和变异链球菌用血琼脂培养，用厌氧培养箱培养，其他步骤同上。

3.2.4 读取结果

用游标卡尺量取每个抑菌圈的直径，以毫米(mm)作单位保留两位有效数字并记录结果。同一样品所对应的两块平板共4个牛津杯，计算其平均抑菌圈直径保留两位有效数字并记录。所得的结果见表2及其备注。

表2

3.3 结果分析

抑菌性能的评价为：抑菌圈<10mm为无抑菌作用，抑菌圈>10mm且<15mm的为中度抑菌，抑菌圈>15mm的为高度抑菌。从表2可见，抑菌圈直径呈梯度。本实验中，样品JM0612在样品浓度为5%(即50mg/mL)时仍对S.A有良好的抑菌作用；在样品浓度为20%(即100mg/mL)时仍对P.G有良好的抑菌作用；而对S.M的抑菌作用较弱。

4 平板稀释法抑菌实验

4.1 主要实验仪器和试剂

AIRTECH生物安全柜、BAKER RUSKINN Concept400厌氧培养箱、THERMO微生物培养箱；脑BHI肉汤、BHI固体培养基、血琼脂平板。

4.2 实验方法

4.2.1 样品的制备

同样是将样品JM0612称取1g用蒸馏水溶解并定容至10mL作为100%的样品液。根据表2的结果，将浓度稀释浓度至50%、25%、12.5%、6.25%。

4.2.2 菌悬液的制备

同3.2.2步骤制作成约107CFU/mL的菌悬液待用。

4.2.3 药物平板的制备和培养

吸取1.5mL各浓度的样品液至平板中，溶解BHI固体培养基，恢复至46℃吸取13.5mL于平板中(此操作相当于把每个浓度再稀释10倍，便于计算其每块平板的用药量)，充分摇匀平板，待其凝固。吸取0.1mL菌悬液用L型涂布棒均匀涂布在BHI固体培养基上。每个浓度两块平板作平行对照，吸取1.5mL生理盐水+13.5BHI作空白对照。三个菌均用固体BHI培养，37℃培养48h。牙龈卟啉单胞菌和变异链球菌用厌氧培养箱培养。

4.2.4 读取结果

记录每块平板上的菌落总数，以CFU作单位并记录。同一样品所对应的两块平板的菌落总数取平均值并记录。其结果如表3和其备注。

表3

4.3 结果分析

4.3.1 初步结果

从表3可读取各最小抑菌浓度(MIC)。本实验中，样品JM0612对S,A的MIC 12.5mg/mL；对P.G的MIC为50 mg/mL。而对S.M的MIC无法得出结果。

5 针对变异链球菌的复实验

5.1 优化方案

步骤参照4.2.1～4.2.4，但样品JM0612称取2g用蒸馏水溶解并定容至10mL作为100%的样品液。然后将其依次稀释至75%、50%、25%，药物平板制备时改为4mL样品液+16mLBHI。其他步骤不变。可总结为100%用药量为为400mg/mL、75%为300mg/mL、50%为400mg/mL、25%为100mg/mL。

5.2 复实验结果

结果见表4和备注。

表4

5.3 复实验结果分析

从表4可知，复实验中，样品JM0612对S.M的MIC为300mg/mL，即可认为表2中在样品浓度20%(200mg/mL)时出现的抑菌圈，不认为其产生抑菌作用。

6 讨论和总结

6.1 牛津杯法和平板稀释法的比较

牛津杯法相对容易操作，但其样品液的渗透受各种原因的影响，如样品液的浓度和澄清程度、琼脂含量的多少、牛津杯插入的深度、培养环境的温湿度都会造成影响，有时会发生在培养48h以后，样品液没有完全渗透到琼脂里的情况。抑菌圈大小能直观显示其有抑菌效果但是无法测定最小抑菌浓度。与牛津杯法的原理相同的还有滤纸片法和牛津杯倾注法，从这种琼脂扩散法的结果来看，不同方法抑菌强弱顺序并不一致，所以几种抑菌方法同时使用时结果有可能不一致，从而造成结果难以判断[6]。而平板稀释法操作较为复杂，但是能够使数值比较精准。关键是选择合适的样品稀释浓度，以及制作药物平板时样品和培养基需要充分混合均匀，使整块平板均匀分布样品液。此方法不仅能反应样品的抑菌性能，还能测定其最小抑菌浓度。

6.2 关于变异链球菌结果的分析

既往研究认为，以变异链球菌和远缘链球菌为代表的变异链球菌群是引起龋齿的主要致病菌[7,8]。因此研究牙膏对变异链球菌的抑菌作用非常关键。在本实验中，样品JM0612对S.M的抑菌圈水平一般，其MIC值高达300mg/mL，这其中的因素可以进行分析，例如提取物的抑菌成分的组成、有效抑菌成分的含量、牙膏的配方和制作、变异链球菌的生物作用机理[9]，菌种的血清分型、菌种的活力或变异耐药等都会对实验结果造成影响。为解决此问题，需要查阅更多的植物提取物的文献，做好实验室的内部监控计划，以及优化和完善抑菌实验方案。

6.3 牙膏评价体系及前景

中药牙膏抑菌性能的评价是中药牙膏功效评价体系的重要支柱。而中药牙膏功效评价体系的建立，减少了以往临床实验的周期，及时掌握牙膏的真实效果，有效地缩短研发和推广周期，在牙膏同质化、竞争白热化阶段，将有较好的应用前景[10]。此外，无机抗菌牙膏技术具有长效、刺激性小、毒副作用小、不产生耐药菌株的特点。生物抗菌牙膏技术具有显著的消炎、杀菌等作用，可作为抗生素的替代品[11]。总而言之，牙膏的技术研究，评价体系的建立是推动行业科技发展进入高质量、规范化、国家化新阶段的必由之路。