基于风险管理的口腔产品和化妆品原料实时微生物快速检验替代方法的方法学验证

郭 莉 贾绍强 刘 燕 琚童霞 余思宜 杨苏成

(云南白药集团股份有限公司,云南 昆明 650200)

在口腔护理产品和化妆品生产中，微生物是必须重点控制的项目。如果消费者使用遭到微生物污染的口腔护理产品和化妆品，会给人们的身体健康造成不同程度的影响[1]，还会影响品牌的良好形象。因此必须严格控制口腔护理产品和化妆品的微生物。我国在化妆品的质量安全方面一直比较重视，随着检测技术的不断发展，在化妆品微生物检测上检测的范围也逐渐增多，2015版《化妆品安全技术规范》[2]要求对于微生物检测主要是细菌总数与霉菌和酵母菌总数。把总数控制于标准以下的前提下，不得检测出耐热大肠菌群、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌。目前按照2015版《化妆品安全技术规范》对微生物的检测方法中，对菌落总数的检测需要两天，霉菌和酵母菌数的检测需要5天，耐热大肠菌群和铜绿假单胞菌的检测需要2～3天，金黄色葡萄球菌的检测需要约3～5天，检验周期较长。公司生产用口腔护理产品原料和化妆品原料面临着用量大、周转快、时间紧的局面，需要引入快速准确的检测技术，在保证检验结果准确可靠的前提下，有效缩短口腔护理产品原料和化妆品原料微生物检验时间，满足快速精准放行需求。当前BioFirst实时微生物快速检测系统以其简便省时、实时快速、准确灵敏、检测量大的特点，充分满足了质量保证所提出的更高要求[3]。

BioFirst实时微生物快速检测系统通过将染色、新的光源和光传感器相结合，能够用同一个检测器同步检测颜色和荧光信号的变化。当代谢过程发生时，试剂的光谱模式会发生改变。光传感器可检测到这些改变，并以预先设定的6分钟为间隔进行监控[4]。该技术目前已被应用于原奶、乳制品、食品保健品、化妆品的微生物检测以及水厂、政府监管部门、科研院所。

初步确认BioFirst实时双温微生物快速检测系统对几种口腔护理产品原料和化妆品原料微生物检测的适用性后，本研究收集了其中两种不同类型的口腔护理产品和化妆品原料二氧化硅H型和山梨醇，参照《中国药典[5](2020版)》附录药品微生物检验替代方法验证指导原则的有关内容，从专属性、检测限、重复性以及耐用性四个方面考察与2015版《化妆品安全技术规范》微生物检验方法相比是否存在差异，评估采用BioFirst实时微生物快速检测系统进行口腔护理产品原料和化妆品原料微生物检验替代2015版《化妆品安全技术规范》微生物检验方法的可行性，为该方法作为口腔护理产品原料和化妆品原料快速检测和放行的可靠方法提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂

BioFirst实时微生物双温快速检测系统，菌落总数检测管，霉菌和酵母菌数检测管，耐热大肠菌群检测管，铜绿假单胞菌检测管，铜绿假单胞菌添加剂，金黄色葡萄球菌检测管，金黄色葡萄球菌添加剂，均为上海美凯纯生物科技有限公司；培养基(广东环凯微生物科技有限公司)，电子天平，高压蒸汽灭菌器，冰箱，生化培养箱，生物安全柜，定量菌种，涡旋振荡器，移液器等。

1.2 试验样品

二氧化硅H型(批号：F2107027 和F2108030)、山梨醇(批号：F2108062 和F2108063)。

1.3 菌种选择

铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希氏菌[CMCC(B)44102)、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉(ATCC16404)、枯草芽孢杆菌(ATCC6633)，均为广东环凯微生物科技有限公司定量菌种。

2 二氧化硅H型和山梨醇替代方法的验证

2.1 专属性试验

2.1.1 样品稀释液的制备:分别称取每种两个批号样品10g，加到装有玻璃珠及90ml灭菌生理盐水的样品瓶中,充分振荡混匀，静置15min。用其上清液作为1∶10的稀释液，每个批号平行取3次。

2.1.2 菌落总数、霉菌和酵母菌数专属性试验方法：取1∶10的样品稀释液(2.1.1制备)按样品限量值(企业内控标准)做进一步稀释；将样品稀释液分装到空试管中，每个试管中分装9mL样品稀释液，加入1mL 102～103CFU/mL的菌落总数菌悬液(按照定量菌株说明书制备大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌混合液)、1mL 102～103CFU/mL霉菌和酵母菌菌悬液(按照定量菌株说明书制备黑曲霉和白色念珠菌混合液)，使样品稀释液含菌量<100CFU/mL；混合均匀后，分别取1mL加入菌落总数检测管、霉菌和酵母菌数检测管内，菌落总数检测管37℃上机检测，霉菌和酵母菌数检测管28℃上机检测，机器自动检测，在机器运行过程出现DT(检测时间)，则表明样品中的菌含量大于限定值；仪器未检出(无DT)，则表明样品中菌含量小于限定值；2015版《化妆品安全技术规范》微生物检测法同步进行检测。

2.1.3 耐热大肠菌群专属性试验方法：选取大肠埃希菌作为菌种。从制备好的10～100CFU/ml菌悬液中取1mL加入到9mL样品稀释液中，使样品含菌量<100CFU。増菌：上述加了菌的样品稀释液转移至90mL乳糖胆盐培养基中，于44.5±0.5℃培养箱中培养18～24h；取増菌后的样液1mL加入到大肠菌群检测管，混匀后上机在44℃进行检测，机器运行过程中，如果出现DT(检测时间)，则样品报告为阳性；仪器未检出(无DT)，则报告为耐热大肠菌群阴性；2015版《化妆品安全技术规范》微生物检测法同步进行检测。

2.1.4 铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌专属性试验方法：分别从制备好的10～100CFU/ml铜绿假单胞菌菌悬液和金黄色葡萄球菌菌悬液中取1mL加入到9mL样品稀释液中，使样品含菌量<100CFU。増菌：分别将上述加了菌的样品稀释液转移至90mL的SCDLP液体培养基中，于36℃±1℃培养箱中培养18～24h；取増菌后的含铜绿假单胞菌样液0.1mL加入到铜绿假单胞菌检测管，另加0.1mL添加剂，混匀后上机在36℃进行检测；取増菌后的含金黄色葡萄球菌样液0.5mL加入到金黄色葡萄球菌检测管，另加0.2mL添加剂，混匀后上机在36℃进行检测；机器运行过程中，如果出现DT(检测时间)，则样品报告为阳性；仪器未检出(无DT)，则报告为阴性；2015版《化妆品安全技术规范》微生物检测法同步进行检测。

2.1.5 专属性试验结果分析：菌落总数BioFirst实时微生物快速检测系统均在20h内检出，霉菌和酵母菌数BioFirst实时微生物快速检测系统均在48h内检出，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、耐热大肠菌群BioFirst实时微生物快速检测系统均在10h内检出；2015版《化妆品安全技术规范》微生物检测法也均检出；两种方法的专属性没有差异。试验结果见表1。

表1 专属性试验结果

2.2 检测限试验

2.2.1 检测限试验方法：方法与专属性试验方法相同，加菌量为使样品稀释液含菌量<5CFU/mL，每个批号样品每种试验菌重复进行10次。

2.2.2 检测限试验结果分析：BioFirst实时微生物快速检测系统对菌落总数和霉菌酵母菌的个位数的菌均能检出，对加到样品中极少的(每g样品中添加0～5个菌)耐热大肠菌群、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌均能够检出，增菌后的样品能够在10小时内快速检出；对菌落总数、霉菌和酵母菌数、耐热大肠菌群、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的检测限结果进行统计，使用Fisher确切概率法分析后显示快检法和国标法检测限试验结果无显著性差异。检测限试验结果见表2。

表2 检测限试验结果

2.3 重现性试验

2.3.1 重现性试验方法：由不同的的实验人员在不同的时间使用相同批号二氧化硅H型和山梨醇进行重现性试验，试验方法同专属性试验方法。

2.3.2 重现性试验结果分析：由不同的实验人员进行试验，菌落总数BioFirst实时微生物快速检测系统均在20h内检出，霉菌和酵母菌数BioFirst实时微生物快速检测系统均在48h内检出，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、耐热大肠菌群BioFirst实时微生物快速检测系统均在10h内检出；2015版《化妆品安全技术规范》微生物检测法也均检出；结果表明两种方法的重现性无明显差异。

2.4 耐用性试验

2.4.1 耐用性试验方法：菌落总数、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和耐热大肠菌群降低培养温度8℃，霉菌和酵母菌数升高培养温度8℃，试验方法同专属性试验方法，对BioFirst实时微生物快速检测系统的耐用性进行试验。

2.4.2 耐用性试验结果分析：升高或者降低培养温度后，BioFirst实时微生物快速检测系统耐热大肠菌群报出的检测时间和专属性试验的基本一致，其他四种菌虽有所延长，也都能给出阳性结果，说明该方法在培养温度适度改变的情况下，检验结果基本不受影响，方法仍可以使用。耐用性试验结果见表3。

试验项目快检法(h)二氧化硅H型F2107027F2108030山梨醇F2108062F2108063菌落总数10.610.610.410.811.011.013.013.014.014.414.815.0霉菌和酵母菌数23.223.423.223.223.223.223.622.222.422.622.622.4耐热大肠菌群2.62.62.62.62.62.62.62.62.62.62.62.6铜绿假单胞菌2.63.33.73.64.14.44.74.23.66.04.44.8金黄色葡萄球菌6.62.62.62.66.36.54.44.94.24.54.54.8

3 讨论

通过对BioFirst实时微生物快速检测系统方法和2015版《化妆品安全技术规范》微生物检测法的专属性、检测限、重复性和耐用性的验证试验，结果表明两种方法基本一致。BioFirst实时微生物快速检测系统方法可作为二氧化硅H型和山梨醇微生物检测的替代方法。但是口腔护理产品原料和化妆品原料种类繁多，有的具有一定抑菌性，需要扩大验证范围，最终确定通用的原料阴性确定时间。BioFirst实时微生物快速检测系统方法在得到准确的检测结果的同时，大大缩短检测时间，避免了配制分装培养基及倾注平板的步骤，简化样品前处理程序，且准确的检测结果使样品微生物检测变得更加快速、方便，有利于产品在获得准确检测结果下的快速放行和质量管理人员的科学决策。